169022. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kopolimer hordozóra felvitt vízoldhatatlan fehérje-készítmények előállítására

7 169022 8 A szuszpenziós úton készült polimerek fehér vagy halványsárga színű gyöngyök amelyek egyes esetekben szabálytalan alakúak, átmérőjük 0,03-3 mm, előnyösen 0,05-0,5 mm, térfogatsúlyuk kb. 1,4-8 ml/g, előnyösen 1,4—5 ml/g. A szuszpenziós úton készült polimerek anhidrid-csoportjainak hidrolízise után megállapított karboxil-csoport-tartalom 0,01 —14 milliekvivalens/g, előnyösen 0,02—11 milliekvivalens/g. A találmány szerinti kopolimerek a kopolimerizálható egységeket statisztikus eloszlásban tartalmazzák. Nagy térhálósűrűségük miatt a kopolimerek minden oldószerben oldhatatlanok, emiatt molekulasúlyuk nem határozható meg. A kopolimerek vízben térfogatsúlyuk 1,1—3-szorosáig terjedően duzzadnak. Igen jól beváltak hordozógyantaként az anhidridcsoporttal szemben reakcióképes anyagok rögzítésére. Ezenkívül kitűnő mechanikai stabilitásuk van és ezzel gyakorlatilag semmiféle kopást nem szenvednek. Az előzőekben leírt hordozógyanták minden olyan funkciós csoportot tartalmazó anyagot megkötnek, amelyek a polimerek anhidrid csoportjaival reagálni képesek. Ilyen anyagok a fehérjék és a peptidek közül mindenekelőtt a lizin véghelyzetű amino-csoportjai és a peptidláncvégek szabad aminő-csoportjai. Ilyen fehérjék és peptidek megkötésénél úgy járunk el, hogy a fehérje keverésben tartott vizes oldatához 0 és 30 C° közötti hőmérsékleten a szükséges polimer mennyiséget hozzáadjuk. A fehérje és a hordozógyanta súlyaránya tág határok között szabályozható és a későbbi felhasználási célnak megfelelően beállítható. Jó hozamokat érünk el, ha 1 súlyrész fehérjére számítva 4—10 súlyrész polimer hordozóanyagot alkalmazunk. Az optimális arányok azonban függnek mind a polimerek összetételétől és szerkezetétől, mind a fehérjék anyagi minőségétől. Számos enzimnél célszerűnek bizonyult, ha azokhoz stabilizátorokat adunk. Stabilizátorként a polietilénglikolok vagy nem ionos nedvesítő anyagok jönnek számításba a felület denaturálódásának csökkentése érdekében, valamint az ismert SH-reagensek vagy speciális enzimeknél a fémionok. A pH-értéket célszerűen egy pH szabályozó szerkezet segítségével a fehérje megkötésének megfelelő optimális pH-értéken tartjuk. Ez a pH-érték 2-9, előnyösen 5-7 között van. Penicillin-aciláz felhasználásánál 5,7 és 6,8 közötti pH értéken való reagáltatás bizonyult célszerűnek. A pH-érték állandósítása céljából a reakcióelegyhez szervetlen bázisokat (pl. alkálilúgokat) vagy szerves bázisokat (pl. tercier szerves aminokat) kell beadagolni. A reakció előrehaladása a pH-állandóan tartásához szükséges lúgmennyiség fogyásából állapítható meg. A reakció befejeződéséhez szobahőmérsékleten, kb. 16 óra, 4C°-on 40 óráig terjedő idő szükséges. Ezután a gyantát leszívatjuk és az ionos módon megkötött csekély mennyiségű fehérje leoldása céljából 0,2-1 mólos puffer-oldatokkal, illetve sókkal mossuk. A gyantán megkötött anyagot elemi analízissel vagy enzimeknél, illetve inhibitoroknál az enzimatikus aktivitásnak, illetve az enzimatikus aktivitás gátlásának mérésével határozzuk meg. A megkötött anyagra számított hozamok a polimer anyagi minőségétől és összetételétől függnek. így pl. aminosavak és kismolekulasúlyú peptidek gyakorlatilag teljes mértékben a kopolimeren megköthetők, de még 5 fehérjék esetében is a kopolimeren megkötött enzimek aktivitása 20 C°-on az eredeti aktivitás 90%-át meghaladó értékig is terjedhet. A technika állása szerint, amely pl. az 1 935 711 és 2 008 990 számú NSzK közrebocsá-10 tási iratokból állapítható meg, a fehérjék megkötését a puffer-oldatokban 0,05—0,2 mólos koncentrációban végezzük. Ha puffer-oldat nélkül dolgozunk, akkor az ionos úton megkötött fehérjék aránya az 1935 711 számú NSzK közrebocsátási 15 irat tanúsága szerint megnövekszik. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti gyantáknál a kapcsolódás lehetőség szerint ionmentes közegben maximális hozamot eredményez kovalens kötésű enzimeket számítva. A 20 pH-érték ilyen munkamódszernél is pH szabályozó szerkezet segítségével igen pontosan az optimális értéken állandóan tartható. Az enzimgyanták alkalmazása műszaki szempontból különösen jelentős, mivel segítségükkel mű-25 szaki szempontból értékes anyagok állíthatók elő. Ha a biológiai katalizátorokat a találmány szerinti eljárással előzetesen megkötjük, akkor egészen egyszerű elválasztási eljárásokkal lehetővé válik a reakciókeverékben teljes elválasztásuk és így megvalósít-30 ható a gazdasági szempontból döntő különféle ismételt alkalmazhatóság. Emellett a legtöbb esetben az érzékeny és drága fehérje-készítmények stabilitása jelentős módon megjavul. A következőkben néhány példát adunk meg 35 olyan hordozóanyaghoz kötött anyagok alkalmazására, amelyek a találmány szerinti eljárással állíthatók elő. A proteázok, mint a tripszin, kimotripszin, papéin, elasztáz csoportja, pl. mikrobiológiai eljárá-40 soknál, fehérjehidrolizátumok előállításánál alkalmazható. Ezenkívül az enzimek felhasználhatók antigén fehérjék eltávolítására gyógyászati hatóanyagokból. Az acilázokat műszaki szempontból 6-amino-45 -penicillánsav előállítására alkalmazzák penicillinekből vagy acilezett aminosavak racemátjainak elválasztásához. A hordozóanyaghoz kötött amiláz felhasználható a keményítő hidrolízissel történő lebontására. 50 Speciális hidrolázok, mint az aszperagináz vagy ureáz kötött állapotban alkalmazható a szervezeten kívüli keringési folyamat befolyásolására gyógyászati célokból. A felsorolt és még számos alkalmazási lehetőség 55 a szakirodalomból ismeretes. Ilyen közleményekként pl. a Chem. Eng. News 1971. február 15-i számának 86. oldalán és a Rev. Pure a. Appl. Chem. 21, 83 (1971) oldalán ismertetett összefoglalásokat említjük. 60 A hordozókhoz rögzített fehérje-készítmények további nagy alkalmazási területe az affinitás-kromatográfia. Ennek megfelelően kötött antigénekkel vagy hepténekkel antitesteket vagy fordítva kötött antitestekkel (gammaglobulin) antigéneket lehet izo-65 lálni. Hasonlóképpen enzimek specifikus úton dúsít-4