168968. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleozid-di- és -trifoszfánok tiofoszfátanalógjainak előállítására
5 168968 6 a természetes nukleotidokat helyettesíthetik és mindenhol alkalmazhatók, ahol az anyagcserében nukleotidok és polinukleotidok résztvesznek. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről a példák szemléltetik. 1. példa [Adenozin-5'-0-(2-tiodifoszfát)-trietilammóniumsó] 5 ml száraz metanol és 0,43 ml (1 mmól) tri-n-oktilamin keverékéhez 347 mg (1 mmól) adenozin-5'-foszfátot adunk szabad sav alakjában és a reakcióelegyet teljes oldódásig gyengén melegítjük. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és a maradékot 5 ml-es részletekben hozzáadott száraz dimetilformamiddal ismételten bepárolva szárítjuk. A száraz maradékhoz 7 ml száraz dioxánt, s ha az anyag azonnal nem oldódik, 1 ml száraz dimetilformamidot adunk, majd 0,3 ml difenilfoszforsavkloridot és 0,3 ml tri-n-butilamint adunk a reakcióelegyhez. Fehér csapadék képződik, amely keverésre feloldódik. A reakciókeveréket 3 órán át állni hagyjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk és a maradékhoz 50 ml száraz étert adunk. A keveréket 1/2 órán át 4C°-on tartjuk, majd az étert dekantáljuk. A maradékhoz 5 ml száraz dioxánt adunk és az így kapott szuszpenziót szárazra pároljuk és tri-n-butilammóniumsó alakjában 2 mmól S-2-karbamoiletiltiofoszfátot és 6 ml száraz piridint adunk hozzá. A keveréket 3 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, ekkor csapadék képződik. A piridint csökkentett nyomáson kidesztilláljuk az elegyből, a maradékhoz 80 ml 0,2 n nátriumhidroxid-oldatot adunk és az így kapott zavaros oldatot 10 percig 100 C°-on melegítjük. Ezt követően a keveréket lehűtjük, Merck I ioncserélővel piridinium-formában semlegesítjük, 0,5 ml /3-merkaptoetanollal kezeljük, szűrjük és DEAE cellulózon 7,5 pH értékű 0,05—0,3 mólos lineáris grádiensű trietilammóniumhidrogénkarbonát-pufferral kromatografáljuk. A terméket 0,22 mól-nál eluáljuk. A hozam az adenozin-5'-foszfátra 35%. A vegyület adenozin-spektruma: \H|0 = 259 nm (e= 15 000). Megelemezve, az adenozin aránya a foszforsavhoz = 1 : 2,07. 2. példa [Adenozin-5'-0-(2-tiodifoszfát)-trietilammóniumsó] 302 mg (1 mmól) dikáliumdihidrogénditiofoszfátot piridinformájú Merck I ioncserélővel ioncserének alávetve piridiniumsóvá alakítunk. A piridiniumsóhoz 2 mmól tri-n-butilamint adunk és vákuumban szárítjuk. A kapott di-(tri-n-butilamin)-dihidrogénditiofoszfátot 4 ml száraz piridinben oldjuk és az S-2-karbamoiletiltiofoszfát helyett alkalmazzuk az . 1. példában leírt eljárásban, mimellett a P1-difenil-P 2 -nukleozid előállításánál 0,5 mmól adenozin-5'-foszfátból indulunk ki. A reakcióelegyet 16 órán szobahőmérsékleten tartjuk, majd az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot 20 ml vízben oldjuk, 2 ml /3-merkaptoetanollal kezeljük, és az 1. példa szerint DEAE-cellulózon tisztítjuk. A hozam, az adenozin-5 -5'-foszfátra 26%. A termék az 1. példa szerinti termékkel azonos. 3. példa 10 [Adenozin-5'-0-(3-tiotrifoszfát)-trietilammóniumső]. 0,5 mmól S-2-karbamoiletiltiofoszfát-lítiumsót a 2. példa szerint ioncserélőn piridiniumsóvá, majd 15 0,22 mól (0,5 mmól) tri-n-oktilaminnal mono-(tri-n-oktilammónium)-sóvá alakítunk. A terméket 3,5 ml száraz dioxánban oldjuk és 0,15 ml difenilfoszforsavkloriddal, majd 0,23 ml tri-n-butilaminnal elegyítjük. Az oldatot 2 órán át szobahőmérsékleten 20 tartjuk, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékhoz 10 ml étert adunk, rövid ideig rázzuk, majd 20 ml petrolétert (40-60 C°) adunk hozzá és a keveréket 1/2 órán át 4C°-on tartjuk. A felső réteget dekantáljuk, a maradékot 3 ml száraz 25 dioxánban oldjuk és az oldatot vákuumban bepároljuk. Az így kapott viszkózus folyadékhoz 3 mj száraz piridinben oldott 0,25 mmól adenozin-5'-difoszfát-[mono- (tri-n-oktilammonium)-mono-(tri-n-butilammónium]-sót adunk és az oldatot 2 30 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékhoz 20 ml 2 n -nátriumhidroxid-oldatot adunk és a keveréket 10 percig 100 C°-on melegítjük. Ezt követően az oldatot lehűtjük, 35 ioncserélő gyanta alkalmazásával semlegesítjük, 0,5 ml |3-merkaptoetanolt adunk hozzá és DEAE-cellulózon 7,5 pH-értékül, lineáris grádiensű 0,15-0,4 mólos trietilammóniumhidrogénkarbonát-pufferral kromatografáljuk. Az előállítani kívánt 40 adenozin-5'-0-(3-tiotrifoszfát)-ot kb. 0,28 mólnál eluáljuk. A terméket DEAE-Sephadex oszlopon 0,35—0,6 mól pufferkoncentrációval újból kromatografálva tisztítjuk. A terméket kb. 0,5 mmólnál eluáljuk. A vegyület adenozin-spektruma: 45 x£i? = 259nm (e=15 000). Megelemezve, az adenozin aránya a foszforsavhoz = 1 : 2,94. 50 4. példa [Adenozin-5 '-0-(2-tiodifoszfát)-diszulfid-trietilammóniumsó]. 55 Az 1. példa szerint kapott adenozin-5'-0-(2-tiodifoszfát)-trietilammóniumsó 1 mmól mennyiséget vízben oldjuk, vizes káliumferricianid-oldatot adunk hozza és szobahőmérsékleten 5 percig állni 60 hagyjuk. A kapott oldatot kromatográfiás papírra visszük fel és 7,5 pH-értéken 2200 V feszültséggel elektroforézissel szétválasztjuk. Az adenozin-5'-0 <2-tiodifoszfát)-diszulfidot metanol-víz 1 :1 keverékével eluáljuk. A „hozam 60%. A vegyület « adenozin-spektruma:XSl? = 259 nm (e = 30 000). 3
