168856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-2,2-dimetil-penam-3-karbonsavszármazékok előállítására kötött enzim alkalmazásával

3 168856 4 A 158 648 sz. magyar szabadalmi leírás gélhez kötött baktériumsejtekkel végzett penicillin-hidrolízist ismertet. Mindezek nyilvánvalóan magasabbá teszik az árakat és jelentősen bonyolultabbá teszik az előállítási technológiát. A találmány szerinti eljárás jelentős javítást eredményez. A szálszerkezetbe foglalt enzimkészítmény nagyon hosszú ideig megtartja aktivitását: a kikísérletezett minták ezen típusai ismételt felhasználáskor hosszú ideig, még 12 hónap elteltével is majdnem változatlanul megtartják aktivitásukat. A szálas szerkezetek meghosszabbított aktivitása következtében a folyamat jelentős mértékű egyszerűsödésének nyilvánvaló előnye mellett, az enzimatikus katalízis költségei csak nagyon kevéssé, vagy majdnem jelentéktelen mértékben terhelik meg a végtermék árát. Az enzimtartalmú szálat rögtön a fonalképzés folyamatától kezdve mossuk, hogy a külsőleg adszorbeálódott szennyezéseket eltávolítsuk. A mosás után ezt a reakció katalizálására használjuk, és mivel a fehérjék nem képesek a reakciótér közepébe átdiffundálni, egy nagyon tiszta és a fentemlített allergiás jelenségek szempontjából veszélyes fehérjeszennyezésektől mentes terméket kapunk. Az oldhatatlan katalizátort szakaszos módon is használhatjuk: ezt kapcsolatba hozzuk a reakciókeverékkel, melyet hidrolizálunk és a hidrolízis befejeztével a reakciókeveréket elválasztjuk és friss keverékkel pótoljuk. Ugyanezt a katalizátort folyamatos eljárásban is használhatjuk, oszlopon. A penicillin oldatát, megfelelően pufferolva, az enzimatikus szálat tartalmazó oszlopon átengedjük, az áramlás sebességét és a szálak mennyiségét megfelelő módon szabályozzuk és így az elfolyó keverékben a legmagasabb hidrolízis fokú terméket kaphatjuk. Ismeretes, hogy ugyanez az enzim savas pH-nál a 6-APA acilezőszereként hat, ily módon lehetővé válik egy új penicillin enzimes szintézise a 6-APA-t és egy karbonsavat vagy származékát tartalmazó reakciókever ékb ől. A hidrolízis céljára használt ugyanazon készülékben lehetőség van félszintetikus penicillin szintézisére is oly módon, hogy az oldhatatlan enzimet a 6-APA-t és a kívánt karbonsavat, vagy inkább ennek más reakcióképesebb származékát, mint például glicinamidját vagy N-acil-származékát tartalmazó keverékkel reagáltatjuk. Az enzimes katalizátort a 836 462 számú olasz szabadalmi leírásban közölt inszolubilizációs módszerrel készíthetjük. Az említett szabadalmi leírás szerint az enzimet tartalmazó szálakat szálképzésre alkalmas polimerek oldatából állíthatjuk elő, melyben az enzimkészítményt emulzió-nagyságrendű nagyon kicsiny cseppekké diszpergáljuk. Az így kapott emulziót nedvesen vagy szárazon fonjuk úgy, hogy a szálak belül kis üregeket tartalmazzanak, ahol elhelyezkedik az enzim, melyet nagyon vékony hártya segítségével a környezetétől elválasztunk, ezzel megakadályozva, hogy az enzim és annak diszperziója a reakcióelegybe kerülhessen, ugyanakkor lehetővé téve, hogy az enzim kifejthesse katalitikus hatását. Az enzimeket magukba foglalni képes polimerek 5 a cellulóz észterezett polimerjei, a nitrátok, a poliolefinek, az akrilnitrilből kapott polimerek és kopolimerek, akrilátok, metakrilátok, vinilészterek, vinilklorid, vinilidénklorid, sztirol, továbbá a poliamidok, polivinil-butirát és más hasonló termékek. 10 A beépített enzimek a penicillin (a-fenoxi-metilpenicillin) enzimatikus hasítására szolgáló penészgombák vagy egyes Actinomyces-félék sejtjeiből kapott nyers extraktumokból származhatnak, vagy 15 ezek a penicillin G (benzil-penicillin) enzimatikus hasítására szolgáló baktériumok (E. coli, B. megaterium, Aerobacter, Aerogenes, Alcaligenes faecalis) sejtjeiből nyerhetők. A 6-APA előállítására szolgáló hidrolízis esetén 20 célszerűen az alkalmazott penicillin sójának vizes oldatából indulunk ki, a koncentrációt 1-6 súly/ /térfogat%, előnyösen 2-3 súly/térfogat% között változtatva. Az oldatot automatikus lúgadagolás segítségével 8,0 körüli pH értéken tartjuk. Folya-25 matos eljárásnál, a pH ellenőrzésének nehézsége miatt a különböző hosszúságú oszlopoknál, megfelelően pufferolt penicillinoldatot használhatunk. A szintézis során előnyös 1-3 súly/térfogat% 30 6-APA-ból és a kívánt savból, vagy ennek származékából, előnyösen glicinamidjából vagy N-acil-származékából kiindulni. A pH értékét automatikusan 6,0 körül tartjuk. Mind a hidrolízist, mind a szintézist 15-60 C°, előnyösen 37-40 C° közötti 35 hőmérsékleten hajtjuk végre. A következő példák részletesebben ismertetik az eljárást, anélkül azonban, hogy az oltalmi kört kizárólag a példák szerinti eljárásokra korlátoznánk. 1. példa Egy reakcióedényben keverés közben 20 g cellulóztriacetátot (Fluka gyártmány) oldunk 280 g 45 metilénkloridban (Carlo Erba gyártmány). Az enzimoldatot E. coli sejtekből készítjük a következőképpen: Az Escherichia coli ATCC 9637 sejteket aerob fermentációval állítjuk elő, a következő összetételű táptalajon: húsextraktum: 10 g/l, pepton 50 10 g/l, NaCl 5 g/l, fenilecetsav 2 g/l, a pH értéke 7,0 és a hőmérsékletet 24 C°-on tartjuk. 20 óra múlva a sejteket lecentrifugáljuk, 0,01 mólos trisz-HCl pufferben (pH 8,5) szuszpendáljuk, és egy 700 kg/cm2 nyomáson működő Manton-Gaulin ho-55 mogenizálón kétszer áteresztve feltárjuk. A szuszpenzióhoz 0,4% hexadecil-piridinium-kloridot adunk és pH-ját 4,5 értékre állítjuk be. A hőmérsékletet 37 C°-on tartjuk. Három óra múlva az oldhatatlan anyagot Alfa-Laval LAB 102B—20 centrifugával el-60 választjuk. A tiszta felülúszóból a penicillinacilázt ammóniumszulfátos kicsapással nyerjük ki (65%-os telítettségnél). A csapadékot visszaoldjuk 30 ml 0,01 mólos 8,0 pH-jú és 30% glicerint tartalmazó nátriumfoszfátpuff erben. Az így kapott enzim-65 oldatot a polimeroldathoz adjuk. 2