168856. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-2,2-dimetil-penam-3-karbonsavszármazékok előállítására kötött enzim alkalmazásával

5 168856 6 A két fázis emulzióját OC°-on 30 percig tartó erős keverés segítségével állítjuk elő. Az emulziót egy -6 C° hőmérsékletű kis olvasztótégelybe öntjük, és ezután fonalat húzunk belőle N2

gázatmoszférában. 5 A polimerfonal a toluolban szobahőmérsékleten koagulál, és ezt egy gombolyagba gyűjtjük Össze. Néhány órán át vákuumban szárítjuk, hogy a toluolt eltávolítsuk. 37 g-szálat egy termosztáló köpennyel körülvett, 10 70 cm magas és 3 cm átmérőjű üvegoszlopba helyezünk.. Vízzel és glicerinnel mossuk addig, míg a fehérjék a mosóvízből eltűnnek. Az oszlopon 600 inl 2 súly/térfogat%-os vizes G-penicillin káliumsó-oldatot vezetünk át. A pH-t 8,0 értéken 15 tartjuk pH-szabályozó műszerrel ellenőrizve, 0,5 n NaOH oldat folyamatos adagolásával. Az oszlopot 37 C°-on termosztáljuk. 5 óra múlva, amikor a lúgfogyasztás sebessége a kiindulásinak 1/20-ára csökken, a reakciókeveréket 20 3 C°-ra hűtjük, 2 n sósavval 3 pH-rá savanyítjuk (33,5 ml 2 n HCl-t használunk) és kétszer 200 ml butilacetáttal extraháljuk. A két szerves extraktumban a penicillintartalmat hidrqxilaminos eljárással mérve, (Proc. Roy. Soc. B 25 164,498 [1961]) ez az első extrakciónál 298 mg-nak, a másodiknál 2 mg-nak adódik. Mivel a penicillin kiindulási mennyisége 12 g, a kitermelés 97%-os. A kromatográfiás vizsgálat nem mutat bomlásterméket. 30 A visszamaradó penicillintől és fenilecetsavtól mentes vizes fázist (800 ml) 33 ml 2 n NaOH hozzáadásával 7,0 pH-értékre állítjuk, és vákuumban 37 C°-on kb. 110 ml térfogatra bepároljuk. A betöményített 6-APA oldatot 0C°-ra hűtjük 35 és a pH-értéket 3n sósavval 4,2-re állítjuk. A 6-APA kicsapódik és ezt szűréssel eltávolítjuk, majd vákuumban 45 C°-on súlyállandóságig szárítjuk. A termék súlya 6,6 g. A 130 ml anyalúgban a 6-APA tartalom 0,4 súly/térfogat%. A kristályos 40 termék hidroxilaminos eljárással mért 6-APA tartalma 97,5%. Az infravörös spektrum, a kromatográfiás vizsgálat és az optikai forgatóképesség azt mutatják, hogy a termék gyakorlatilag tiszta. 45 A fentiekkel teljesen azonos módon való eljárással száz 6-APA készítményt állítottunk elő 6 hónap alatt, mindig ugyanazt a szálat használva, anélkül, hogy jelentős termelékenység veszteségünk lett volna. 50 2. példa Az 1. példával azonos körülmények között dol- 55 gozva egy gombolyagot állítunk elő, melynek fonalára az 1. példában alkalmazott módon tizenötszörösen tisztított, E. coli sejtekből készült enzimkészítményt viszünk fel. Az így kapott szál ugyanolyan súlyú mennyisége 60 tízszer nagyobb aktivitást mutat, mint az előző példa szálas anyaga. Az 1. példában leírt oszlopban (480 ml) 37 g szálat helyezünk el. A szálat vízzel és glicerinnel mossuk, míg a mosófolyadék fehérjementes lesz. 6S Egy 5 literes tartályba 3 liter 2 súly/térfogat%-os vizes G-penicillin káliumsó-(Squibb gyártmány)-oldatot helyezünk. Az oldatot egy perisztaltikus pumpa segítségével folyamatosan a szállal töltött oszlopba tápláljuk, mely egy adagolótartállyal van összekötve. A penicillin hidrolízis időtartamának csökkentésére szükséges, hogy a reakcióközeg számára a tökéletes homogenitást biztosítsuk, ezért az adagoló tartályt erősen keverjük és a recirkuláló mennyiséget 500 ml/perc értéken tartjuk. A pH-t 8 értéken tartjuk, automatikus pH-mérő műszerrel szabályzott 0,5 n vizes NaOH oldat-adagolással. A reakciókomponensek hőmérsékletét 37 C°-on tartjuk, az oszlop automatikus termosztálásával. Az NaOH oldat fogyásának regisztrálásával követjük a hidrolízis kinetikai lefolyását. Két óra és 10 perc múlva a lúgfogyasztás sebessége a kezdeti sebességnek 5%-ára csökken. Ekkor a reakciót megállítjuk és a cirkulációt megszüntetjük. A termék kb. 310 ml 0,5 n NaOH oldatot fogyaszt. A cirkulációs folyadék kb. 3 300 ml vizes oldat, mely 6-APA-t, a penicillin hidrolíziséből képződött fenilecetsavat és maradék penicillint tartalmaz. A fenilecetsavat és a penicillint butilacetátos extrakcióval távolítjuk el a reakciókeverékből. Ezt két egymás utáni extrakcióval végezzük, egyenként 1100 ml friss oldószert alkalmazva. Egy keverővel felszerelt 6 Uteres tartályban az összegyűjtött reakcióelegyet 5 C°-ra lehűtjük és 1 n sósav vizes oldatának adagolásával a pH-t 3 értékre állítjuk. Ehhez 1100 ml butilacetátot adunk és addig keverjük, míg a két fázis között diszperzió jön létre (vizes és szerves fázis). A keverés során, mely 15 percig tart, folyamatosan 1 n sósavat adagolunk, hogy a pH-értéket változatlanul tartsuk. A fázisokat 5 C°-on 20 percig hagyjuk szétválni. Alul kapjuk a vizes fázist, mely a nagyon kis cseppek formájában jelenlevő oldószernyomok következtében zavaros fényű: felül a tiszta, átlátszó szerves fázis van. A rendszert választótölcsérrel három fázisra osztjuk, a butilacetát/víz emulzióban levő vizes fázist centrifugálással kinyerve. Az egész vizes fázist ismét 1100 ml friss oldószerrel az első extrakcióval azonos körülmények között kezeljük és a vizes fázist analóg módon kinyerjük. Az extrakció folyamán 180 ml vizes 1 n HCl oldatot használunk. A két butilacetátos frakcióban, hidroxilaminos módszerrel mérve meghatározzuk a penicillin tartalmat. Az első extrakcióból származó frakcióban meghatározott koncentráció 3 mól/ml, míg a második frakcióban nem mutatható ki penicillin. Az extrakcióból származó vizes fázist 165 ml 1 n vizes NaOH oldat hozzáadásával 6,9 pH-ra állítjuk és vákuumban bepároljuk. A bepárló termosztáló fürdőjét 45C°-on tartjuk, a kondenzálóban pedig friss folyadékot áramoltatunk, melynek hőmérséklete -5 C . A vákuumszivattyú 1 Hgmm nyomáson működik. 5 órán belül a vizes fázis térfogata a kiindulási térfogat 1/8-ára csökken. Az egy literes tartályban összegyűjtött maradékot 2 C°-ra lehűtjük és a pH-t 6 n HCl hozzáadásával 4,2 értékre állítjuk. A pH csökkentése 3