168850. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hisztaminopexiás hatású glükoproteinek előállítására

3 168850 4 ugyanis sokkal kisebb moláris koncentrációjú ammóniumszulfát-oldattal is ki lehetne csapni, - a Sephadex G 200 gélszűrőn végzett meghatározás szerint a termék molekulasúlya valamivel nagyobb, mint az immunoglobulinoké, - gradiens elektroforézissel végzett meghatározások szerint mobilitása agarózon, cellulózacetáton vagy szacharózon prealbuminokénak felel meg, - izoelektromos pontja az elektroforézises meghatározás szerint pH 4,0 értékhez esik közel. A jelen találmány tárgya eljárás elektroforézis szerint pH 4 í 0,2 izoelektromos ponttal rendelkező, miligrammonként legalább 106

hisztaminopexiás aktivitással rendelkező, az ismert eljárással előállítható glükoproteineknél tisztább hisztaminopexiás hatású glükoproteinek előállítására emberi szérumból vagy placentából. Közelebbről, a találmány tárgya eljárás olyan emberi vagy placentális eredetű hisztaminopexiás hatású glükoprotein előállítására, amely 53—59%, előnyösen 56% proteint, 16-18%, előnyösen 17% hexózt, 1,2-1,4%, előnyösen 1,3% fukózt, 13-15%, előnyösen 14% ozamint és 14-16%, előnyösen 15% terminális szialinsavat tartalmaz, molekulasúlya pedig legalább 100 000, előnyösen 110 000. A találmány szerint oly módon járunk el, hogy emberi vagy placentális eredetű szérum proteinjeit 7 pH-nál ammóniumszulfáttal, annak koncentrációját 0-tól 1,9-mólra, 1,9 mólról 2,4 mólra, majd 2,4 mólról 3,3 mólra növelve három frakcióban kicsapjuk, a harmadik frakcióban kapott protein-tartalmú csapadékból vizes oldatot készítünk, az oldatot feleslegben vett 0,1 n fitinsawal kezeljük, szűrjük, a szűrletet nem-ionos polimer alapú szelektív membrán felhasználásával dializáljuk, a dializáló cellában visszamaradt protein-frakciót 4,2 pH-jú karboximetilcellulóz gélen kromatografáljuk, majd az oszlopon meg nem kötött glükoproteint elkülönítjük. A vegyületek protein-tartalmát a biuret-reakción alapuló Gornall-féle kolorimetriás eljárással [J. Biol. Chem. 177, 751 (1949)] és a Lowry-féle kolorimetriás eljárással [J. Biol. Chem. 193, 2-65 (1951)] határoztuk meg. A százalékos elemanalízissel megállapítottuk a glükoprotein százalékos szén-, hidrogén- és nitrogén-tartalmát. A glükoprotein hexóz-tartalmát 2: 1 galaktóz-mannóz keverékkel összehasonlítva rezorcin-módszerrel határoztuk meg [Bioch. Zeitung 215, 36 (1929)]. A termék speciális cukortartalmát Elson-Morgan eljárással [Biochem. Journal 27, 1824 (1963)] határoztuk meg. Ezzel a módszerrel állapítottuk meg a fukóz, az ozamin és a terminális szialinsav mennyiségét. A glükoprotein polipeptid-láncában jelenlevő aminosavak fajtáját és eloszlását sósavas hidrolízis után határozhatjuk meg. A termék molekulasúlyát metilén-bisz-(poliakrilamid) gél segítségével gradiens koncentráció-módszerrel határoztuk meg. A módszer lényege, hogy a vizsgálandó proteint és egy ismert molekulasúlyú proteint egy olyan gélen futtatjuk, amelynek sűrűsége fokozatosan és állandóan nő. A vizsgált anyag egy bizonyos pontnál nem halad tovább. Ez a pont a molekulasúlyára jellemző, amely azután az 5 összehasonlító vegyület ismert molekulasúlya alapján kiszámítható, összehasonlításul ismert molekulasúlyú szabványos albumin-frakciókat alkalmazhatunk. A találmány szerinti eljárással előállítható glü-10 koproteinek a tengerimalacok izolált ileumának hisztamingörcsét éppúgy gátolják, mint a 164 498 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett termékek, a találmány szerinti eljárással készített glükoproteinek azonban jelentősen aktívabbak. 15 A találmány szerinti eljárással előállított hisztamingátló hatású glükoproteinek a gyógyászatban alkalmazhatóak hisztamin által kiváltott kórtűnetek, így urticaria, szénanátha és különböző allergiák kezelésére. 2o A termékek alkalmazhatók továbbá a keringésben résztvevő biológiai aminők, így katecholaminok túlzott mennyisége által előidézett kóros tünetek kezelésére. A glükoproteinek a nagy aktivitás és nagy tisztaság következtében a gyógyá-25 szatban nagy szerephez jutnak. A találmány szerinti eljárással előállított glükoproteineket gyógyászati készítmények hatóanyagként alkalmazhatjuk. A glükoproteineket közömbös hordozóanyagokkal együtt parenterális, rektális, 30 helyi vagy permukális úton adagolható készítményekké alakíthatjuk át. Ilyen készítmények például az injektálható oldatok vagy szuszpenziók, szuppozitóriumok, szublinguális tabletták, jól felszívódó krémek vagy aero-35 szólok. A glükoproteinek dózisa a kezelendő kórtól és az adagolás módjától függ. A hisztamin-gátló glükoproteinek előállítására szolgáló, találmány szerinti eljárás lényege, az, hogy 40 az emberi vagy állati szérumból vagy placentából származó proteineket nem-ionos polimer-alapú szelektív membránon keresztül dializáljuk, a dializáló cellában visszamaradt proteinfrakciót elkülönítjük, karboximetilcellulóz gélen 4,2pH-nál végzett kro-45 matografálással tisztítjuk és az oszlopon meg nem kötött frakciót elkülönítjük. A találmány szerinti eljárást célszerűen az alábbi műveleti feltételek mellett valósítjuk meg: 50 1) Nem-ionos polimer-alapú membránként például az AMICON XM 100A vagy AMICON XM 300 néven forgalomba kerülő termékeket alkalmazzuk (gyártó: Amicon Co, USA). Mindkettő szelektív porozitású membrán, az előbbi a 55 480 000-nél nagyobb, az utóbbi a 960 000-nél nagyobb molekulasúlyú anyagok szelektív visszatartására alkalmas. 2) Az alkalmazott karboximetilcellulózt a hisztaminopexiás hatású glükoproteinek izoelektromos 60 pontjánál valamivel magasabb pH-értéken hozzuk egyensúlyba, a duzzasztást például 4,2 pH-jú acetecetsavas pufferrel végezhetjük. A találmány szerinti eljárás az alábbiakban - az oltalmi kör korlátozása nélkül - példák segítségével 65 mutatjuk be. 2