168850. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hisztaminopexiás hatású glükoproteinek előállítására

5 168850 6 1. példa Hisztaminopexiás hatású glükoproteinek előállítása disznószérumból a) Ammóniumszulfátos kisózás 12,5 liter szérumot egyenlő' térfogatú 4 ezrelék koncentrációjú nátriumklorid-oldattal hígítunk, majd az oldatot az alábbi töménységű ammóniumszulfát-oldatokkal sózzuk ki: 0-1,9 mólos pH = 7 1,9-2,7 mólos pH = 7 2,4-3,3 mólos pH = 7 A harmadik frakciót 8 ezrelék koncentrációjú nátriumkloridoldatban feloldjuk, sómentesített vízzel gondosan dializáljuk, majd a kapott 3,5 liter oldatot 1,5 literre betöményítjük. b) Fitinsavas kicsapás A fentiek szerint előállított minta térfogata 1,5 liter, protein-koncentrációja 80 ezrelék. Az oldatot 3 térfogat sómentesített vízzel hígítjuk, kb. 2n sósavval 2,10 pH-értékig savanyítjuk, majd keverés közben lassan 6 térfogat 0,1 n fitinsawal (pH = 2,10) elegyítjük. Ellenőrizzük, hogy a felülúszóból kivett aliquot rész fitinsawal már nem ad csapadékot, majd az elegyet 24 órán keresztül +4C°-on állni hagyjuk. Ezután az elegyet szűrjük vagy centrifugáljuk, majd a fitinsavas felülúszó pH-ját kb. 2n nátriumhidroxidoldattal 6-ra állítjuk be. c)Dializálás AMICON XM 100A membránon keresztül A fentiek szerint előállított 15 liter fitinsavas felülúszót kb. 10 térfogat sómentesített vízzel szemben dializáljuk 0,7 atm nyomáson. Az elegyet ezután ultraszűréssel 200 ml-re töményítjük be, majd liofilizáljuk. Ilyen módon 5 g súlyú port kapunk. d) Kromatografálás karboximetilcellulózon Ismeretes, hogy a karboximetilcellulóz-nátriumsó gyengén savas ioncserélőnek tekinthető. A keresett glükoprotein izoelektromos pontja az elektrofokalizációs mérések szerint 4,0 ±0,1. A legnagyobb mennyiségben jelenlevő albumin szennyeződés izoelektromos pontja 4,9. A proteinek a 4,2 pH-jú pufferben az izoelektromos ponthoz viszonyítva lúgos közegben vannak, negatív töltéssel rendelkeznek és így az ioncserélő oszlopon nem kötődnek meg. A szérumproteinek közül egyedül az orozomukoid ŰÍT szeromukoidsav rendelkezik olyan izoelektromos ponttal, hogy 4,2pH-n negatív töltései következtében nem adszorbeálódik az oszlopon (a vegyület izoelektromos pontja 2,7). Az egyéb szérumproteinek izoelektromos pontjuknál savasabb közegben vannak és így 5 az oszlopon megkötődnek. Ezeket a proteineket az alábbi három pufferrel lehet lemosni. Az egymás után alkalmazott pufferek állandó ionerősség mellett növekvő pH-val rendelkeznek. 1)0,1 mólos acetecetsavas puffer, pH = 4,2 (Az anyagok felvitelére) 2)0,1 mólos acetecetsavas puffer, pH = 4,8 (az anyagok eluálására) 15 3) 0,1 mólos acetecetsavas puffer, pH = 5,5 (az anyagok eluálására) 4) 0,025 mólos nátriumhidroxid-oldat (Az anyagok eluálására) 20 A kromatografálás során „CMC 52" kereskedelmi név alatt forgalomba kerülő előduzzasztott karboximetilcellulóznátriumsót alkalmazunk (gyártó: Whatmann cég). Az első felhasználás előtt a terméket óvatosan előkezeljük, majd az 1) pufferrel egyen-25 súlyba hozzuk. A kromatografálást 35 mm átmérőjű, 60 cm hosszú oszlopban leszálló technikával végezzük. Az oszlop porózus lemezzel van elzárva és mindkét 30 végén állítható magasságú dugattyúval van ellátva. Az oszlopra felviendő protein-mintából az 1) pufferben 2,5%-os oldatot készítünk. 35 Két oszlopon az alábbi két mintát kromatografáljuk: a) XM 100A membránon dializáit dísznószérum-terméket 40 b) XM 300 membránon dializáit disznó szérum-terméket. A kromatografálás során az anyagáramlás folyto-45 nosságát Perplex LKB szivattyúval biztosítjuk és így elkerüljük az eluátum visszaáramlását. Az áramlási sebesség 15 ml/óra • cm2. A kromatografálásoknál az egyes eluáló puffe-50 reknek megfelelő frakciókat frakciószedővel összegyűjtjük, dializáljuk, betöményítjük és liofilizáljuk. A kolonna eluálását szakaszos gradiens-módszerrel végezzük a három fent megadott pufferrel. A 55 puffereket akkor váltjuk, ha az eluátum már nem mutat abszorpciót 240 m/u-nal. Az első, lassan kifolyó frakció tartalmazza a hisztamin-blokkoló hatású glükoproteineket. A 60 frakcióból liofilizálás után 300 mg termék különíthető el. Az alábbi táblázatból látható, hogy az elkülönítési művelettel mintegy 130 000-szeres dúsítást és 65 összesen 19-szeres aktivitásnövekedést értünk el. 3