168823. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cef-3-ém-4-karbonsav-származékok előállítására

13 168823 14 réteget elkülönítjük. A hideg vizes réteg tartalmazza a kívánt termék nátriumsóját. Ezt az oldatot oszlop-kromatográfiával tisztítjuk tovább, IRA-68 gyantát alkalmazunk nitrát-ciklusban, eluálószerként pedig 7,0 pH-értékű 0,02 mól-os foszfát-pufferoldatot használunk. A tisztított végtermék hozama 1,74 g, ez a termék vékonyréteg-kromatográfiával vizsgálva egyetlen foltot mutat. A termék forgatási szöge 192°. A terméket magmágneses rezonancia-színképe alapján azonosítottuk, ez igazolja a 3-karbamoiloximetil-7-metoxi-7j3-tienilacetamido-cef-3-em-4-karbonsav szerkezetet, op.: 165—167°. A fenti eljárás során kiindulási anyagként felhasznált 3-karbamoiloximetil-7-metoxi-7(3-(D-5-amin o -5-karboxivaleramido)-cef-3-em-4-karbonsav-mononátriumsót az alábbi módon állítjuk elő: A 3-karbamoiloximetil-7-metoxi-7/3-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-cef-3-em-4-karbonsav-mononátriumsó előállítása. Módosított fermentációs eljárás: 1. lépés: Ferde ágáros tenyészet előállítása. A Streptomyces íactamdurans NRRL 3802 törzs iiofilizált kultúráját a kémcső aszeptikus körülmények között történő felnyitása után átoltjuk az alábbi összetételű ágáros táptalajra: XI. tápközeg: Melasz 1% sörélesztő 1% Difco agár (pH = 7,0) 2,5% A fenti összetételű táptalajjal készített ferde ágárokra ráoltott kultúrát 7 napig inkubáltatjuk 28 C° hőmérsékleten. A ferde ágár-készítmények hidegen 13 hetet is meghaladó ideig biztonságosan tárolhatók bomlás veszélye nélkül. 2. lépés: Kétfokozatú átoltás. Első átoltás: az előző lépésben kapott ferde ágáros tenyészetet egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő, 7,0 pH-értékű, 1% primer szárított élesztőt tartalmazó 40 ml tápközegre oltjuk át. A lombikot 220 fordulat/perc sebességgel működtetett forgó rázókészülékben, 5 cm lökettel, 2-3 napig rázatjuk. Második átoltás: első átoltásból kapott inokulum 2,5% mennyiségét átoltjuk egy másik lombikba, amely 2% Fleischmann-féle „S-150" élesztő-autolizátumot tartalmaz, pH-értéke 7,0. Ebben a fokozatban a kultúra jellegzetes világos színnel szaporodik. Az inkubáltatást legfeljebb 48 óra hosszat folytatjuk. 3. lépés: Termelő tápközeg. A termelő tápközeg összetétele: cefresűrítmény 30 g primer szárított élesztő 7,5 g desztillált víz 1 liter Mobilpar-S habzásgátló (emulgeált ásványolaj-termék) 0,25 tf.%. pH-érték 7,0 5 A pH-értéket kismennyiségű tömény nátrium-hidroxid-oldattal állítjuk be, majd az így elkészített tápközeget Erlenmeyer-palackokba osztjuk szét és autoklávban, 121 C° hőmérsékleten 15-20 per-10 cig sterilizáljuk. Lehűlés után a 2. lépésben kapott inokulum 2,5% mennyiségével oltjuk be az egyes lombikokat. Az inkubáltatási idő 50 óra és 100 óra között lehet, előnyösen 72 óra körüli ideig inkubáltattunk. Az egyes lombikokba bevitt táp-15 közeg mennyisége 30-50 ml lehet, általában 40 ml mennyiségekkel dolgozunk. Az inokulum mennyisége is változó lehet, általában 1% és 5% között, a gyakorlatban azonban 2,5% inokulummal célszerű dolgozni. 20 4. lépés: Meghatározás. A fermentáció befejeztével a mikroorganizmus-sejteket centrifugálással eltávolítjuk és a ferment-25 levet 7,0pH-értékű foszfát-pufferoldattal hígítjuk. Az így kapott lében a szokásos papírkorong-módszerrel, biológiai úton határozzuk meg a 3-karbamoiloximetil-7-metoxi-7j3-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-cef-3-em-4-karbonsav koncentrációját. A 30 meghatározáshoz mikroorganizmusként Vibrio percolans ATCC 8461 törzset alkalmaztunk. A szűrőpapír-korongokat bemerítjük a hígított fermentlébe és ráhelyezzük az említett mikroorganizmus-törzzsel előzőleg beoltott ágár-lemezt tartalmazó petri-csé-35 szében a táptalaj felületére. Ugyancsak ráhelyezünk a felületre olyan szűrőpapír-korongokat, amelyeket a 3-karbamoüoximetil-7-metoxi-70-(D-5-amino-5--karboxivaleramido)-cef-3-em-4-karbonsav ismert koncentrációjú standard oldataiba mártottunk be 40 előzőleg. A petri-csészéket a fenti módon ráhelyezett korongokkal éjjelen át inkubáltatjuk 28 C° hőmérsékleten, majd mérjük a mutatkozó gátlási zónák átmérőjét. Az antibiotikumnak a fermentlében levő koncentrációját számítással állapítjuk 45 meg, az ismert koncentrációjú standard-oldatok gátlási zóna-átmérőit mutató standard görbére történő interpolációval. Ezzel a módszerrel számítva azt az eredményt kapjuk, hogy a Streptomyces Íactamdurans NRRL 3802 törzzsel lefolytatott 50 fermentáció terméke — a fenti leírt módosított fermentációs eljárás alkalmazásával -78,6 Mg/ml 3-karbamoiloximetil-7-metoxi-7j3-(b-5-amino-5 -karb -oxivaleramido)-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmaz. 55 5. lépés: Az antibiotikum kinyerése. A fentiek során kapott leszűrt fermentlé pH-értékét híg sósavval 7,0-ra állítjuk be és 2900 ml így beállított fermentlevet átfolyatunk egy sztirol-divi-60 nilbenzol-alapú erősen bázisos, klorid-ciklusú anioncserélő gyanta (Dowex 1X2) 100 g mennyiségét tartalmazó oszlopon, percenként 10 ml áramoltatási sebességgel. Az oszlopot azután vízzel mossuk, majd 3% ammónium-kloridot tartalmazó 90%-os 65 metanollal eluálunk. Az eluátumot 100 ml-es frak-7