168683. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóz-, valamint fruktóz és glukóztartalmú szirup előállítására szál-struktúrákba beépített glukózizomerázok segítségével
3 168683 4 ható, kis belső üregekkel, melyekben az enzim a környezettől igen vékony hártyával elválasztva helyezkedik el; ez elzárja az enzim kivezetését és veszteségét a reakciómasszában, de mégis lehetővé teszi, hogy katalizáló hatását kifejtse. A hivatkozott olasz szabadalmi leírástól a találmány szerinti megoldás lényegesen eltér a tekintetben, hogy utóbbi természetes alapú termékeken lefolytatott enzimatikus reakcióra vonatkozik, ahol a glükóz mellett más komponensek is jelen vannak. A találmány szerinti eljárás segítségével biztosítjuk, hogy az enzimatikus készítmény nem marad a reakcióelegyben és így a kölcsönös szennyeződés kiküszöbölhető. Igen lényeges és meglepő előny továbbá a találmány szerinti eljárásnál, hogy a végtermék mentes minden mikrobiális vagy bakteriális anyagtól, mely egyébként előre várhatóan a szálas szerkezeten koncentrálódhatna. Az enzim-szálak előállítására szolgáló polimereknek azzal a képességgel kell rendelkezniök, hogy folyékony halmazállapotúak legyenek az enzim stabilitásának megfelelő hőmérsékleten és jól elegyedjenek az oldószerrel, melyben az enzimet feloldjuk vagy diszpergáljuk. Az oldószerrel szembeni követelmény, hogy ne legyen ártalmas az enzim stabilitására és az enzimet ne inaktiválja. Nedves szálképzés esetében a koagulálószernek is elegyednie kell a polimer oldószerrel és azonos jellemzőkkel kell rendelkeznie, mint a fenti oldószernek. Enzimek beépítésére alkalmas néhány polimer: észterezett cellulóz polimerek, nitrátok, poliolefinek, akrilonitrilekből, akrilátokból, vinilészterekből, vinilkloridból, vinilidénkloridokból, sztirolból, valamint poliamidokból, polivinilbutirálból és hasonló vegyületekből kapott polimerek és kopolimerek. Észterezett cellulóz polimerek alkalmazása igen előnyös a találmány szerinti eljárásban. A szokásos enzimatikus izomerizálás alkalmazása előnyeinek a megtartása mellett a találmány jelentős tökéletesítéseket vezet be. A beépített enzim aktivitása igen sokáig megmarad, így korlátlan számú alkalommal használható fel, ami pozitívan tükröződik vissza a gazdaságosságban. Az aktivitás tartós megmaradása következtében lehetséges különlegesen tiszta enzimkészítményt beépíteni, anélkül, hogy a tisztítási költség jelentősen kihatna az eljárásra. Ez lehetővé teszi igen aktív szálak előállítását, és ez megengedi a rövid munkaidőt olyan hőmérsékleten és pH-nál, amelynél elkerülhető a cukrok bomlása és így csaknem színtelen végső oldatokhoz jutunk, ami a derítőszén tekintélyes megtakarításával jár együtt. Ezenfelül az enzimfehérje nem diffundál be a reakcióközegbe és a terméket sem szennyezi. Másik nagy előny a folyamatos művelet lehetősége a felszerelés nyilvánvaló egyszerűsödésével, valamint a folyamat szabályozásának a lehetősége. Az áramlás, a szálak mennyiségének és enzim-koncentrációjának hozzávetőleges szabályozásával lehetőség van az izomerizálást kívánt kifolyási szinttel lefolytatni. Az itt leírt eljárás ciklusokban vihető keresztül, ahol az enzimszubsztrát érintkezés a kívánt izomerizálási fok eléréséhez szükséges ideig tart. így az izomerizált szirup eltávolítható és újabbal helyettesíthető, miközben ugyanazon enzim-szálat újra felhasználjuk. A beépítendő enzimet megfelelő mikroba-nyersanyagból extraháíhatjuk. Beépíthetjük nyers kivonat formájában mechanikai feltörés vagy sejt-oldás után, vagy pedig a fehérje-tisztítás szokásos módszereivel megtisztíthatjuk. 5 Az izomerizálás lefolytatásának a hőmérséklete 30— 70 C fok, előnyösen 40—45 C fok között változik; a pH 5,0—9,0 között van, előnyösen 7,0. Az izomerizálandó oldat 50%-os vizes pufferezett glukózoldat lehet, mely kismennyiségű Mg++ és Co + + 10 iont tartalmaz, vagy pedig keményítőből glukoamiláz hatására létrejövő glukóz-oldatból állhat. A következőkben leírt példák egyéb módszereket is ismertetnek a találmány jobb megvilágítása céljából. 1. példa Streptomycin sejtek oldásával és ezt követően aceto-20 nos kicsapással előállított glukóz-izomeráz víz/glicerin (72:25) oldatát használjuk fel a fenti enzim beépítésére; az oldat jellemzői a következők: aktivitás 364 egység/milliliter (1 egység az enzimnek az a mennyisége, amely 1 milligramm fruktózt, 0,5 M glukózt képez 7 25 pH-nál 1 óra alatt 45 C fokon). Fehérje 22 milligramm/ milliliter. 20 gramm cellulóztriacetátot (Fluka) keverés közben feloldunk 266 gramm meíilénkloridban. E polimer oldathoz 40 gramm enzimoldatot adunk és a két fázis 30 emulgeálásáí erőteljes rázassál segítjük elő 0 C fokon, 30 percen keresztül. Az emulziót olvasztó tégelybe öntjük, — 6 C fokon tartjuk és nitrogén-nyomás alatt szálat képezünk belőle. A szálat toluollal szobahőmérsékleten koaguláljuk és 35 csévélőn. gyűjtjük össze. Vákuumban 0 C fokon a szerves oldószerek eltávolításához szükséges ideig szárítjuk. Az így kapott 2,8 gramm rostot — amely 1,4 gramm száraz polimernek felel meg — 0,05 M foszfát-puffer-40 rel (pH = 7) mossuk az adszorbeált enzim eltávolítása céljából és fokozatosan belehelyezzük 25 ml vizes oldatba, mely 10~4 M CoCI 2 -ot és 5,10-3 M MgCl 2 -ot, valamint 60% glukózt tartalmaz. Az oldatot rázzuk 45 C fokon és a pH-t NaOH hoz-45 záadás útján 7-es értéken tartjuk, pH-mérővel ellenőrizve. 24 óra múlva 45,5%-nak megfelelő izomerizálási fokot állapítunk meg polariméter segítségével. Az izomerizált oldatot eltávolítjuk és ugyanazt a szálat friss glukóz-oldattal hozzuk érintkezésbe egy újabb izo-50 merizálási ciklushoz. 6 napi művelet után az izomerizálási százalék 41%, 12 nap múlva 28,7%, 18 nap múlva 26,5%. Az elválasztást 45 nap után végezzük el. Az izomerizált szirup egy részéből a fruktózt elválasztjuk, ioncserélő gyantával végzett előzetes ion-men-55 tesítés után, a fruktózt lúgos pH-n kalciummal kicsapva. 2. példa 60 Az 1. példában leírtak szerint elkészített glukóz-izomerázt tartalmazó 25 gramm rostot úgy helyezünk el egy üvegoszlopban (1,3 X40 cm), hogy a rostok egymással párhuzamosak legyenek, és hőmérsékletét ter-65 mosztáttal 45 C fokon tartjuk. 0,05 M 7 pH-jú fosz-2
