168486. lajstromszámú szabadalom • Eljárás coronavírus-szerű borjú-hasmenés-virus legyengítésére, valamint a legyengített vírust tartalmazó készítmény, főként vakcina előállítására

7 168486 8 A vakcina készítése és felhasználása A találmány szerinti eljárás részletesebb szemléltetésére az alábbiakban leírjuk a vakcina célszerű elkészítési módját, meg kell azonban jegyezni, hogy a találmány nincsen erre a példaként leírt konkrét 5 módszere korlátozva. A fentiekben ismertetett coronavírus-szerű vírust, amelyet bármely fajtájú coronavírusos hasmenéses megbetegedéssel fertőzött borjúból a betegség bármely szakában vehetünk, az AmJorunal of Vete- ^Q rinary Research 33, 1147-1156 közleményében leírt módon borjúmagzat vese-sejteken tenyésztjük. Tenyészthető azonban ez a vírus másfajta borjúszövetek sejtjein vagy egyéb sejt-tenyészeteken is. Ismert módon egysejtes sejtréteg-kultúrát készítünk és ezt beolt- 15 juk a coronavírus-szerű vírussal.Általában olyan módon járunk el, hogy az egysejt-réteges kultúrát Hanks-féle pufferezett sóoldattal mossuk, majd hozzáadjuk a vírus-inokulumot és néhány óra hosszat - általában 2 óra elegendő erre a célra — 37°C körüli hőmérsékle- 20 ten állni hagyjuk, hogy a vírusok abszorbeálódhassanak a sejtekbe. A sejtkultúrához ezután Earle-féle pufferezett sóoldatot adunk, amely 0,5% laktalbumin-hidrolizátumot és 0,1% élesztőkivonatot is tartalmaz, továbbá 100 egység/ml penicillint és 200 25 mcg/ml sztreptomicint adunk hozzá és az így kezelt kultúrát 30-40°C, előnyösen 37°C körüli hőmérsékleten 2-10 napig inkubáljuk. Ezután a vírust elkülönítjük, például oly módon, hogy a szupernatáns folyadékot dekantáljuk a sejtekről. Vírus-inokulum- 30 ként például a coronavírus-szerű vírussal fertőzött borjak ürülékéből vett anyagot, vagy pedig például magzati borjú-vesesejt kultúrán előzetesen tenyésztett coronavírus-szerű vírus kultúrájából származó folyékony kultúra-közeget alkalmazhatunk. A fertőzött 35 borjak ürülékét vagy közvetlenül természetes állapotban alkalmazhatjuk erre a célra, vagy pedig 7,2 pH-értékű foszfát-pufferrel pufferezett sóoldattal hígíthatjuk az ürüléket, majd 1000 g-nek megfelelő fordulatszámmal 20 percig centrifugaijuk és a szuper- 40 natáns folyadékot alkalmazzuk inokulumként. A fenti összetételű Earle-féle tápközeg helyett másfajta közegeket is alkalmazhatunk a sejtkultúia fenntartására, például laktalburnin-hidrolizátumot tartalmazó módosított Earle-féle tápközeget. Az erre a ^ célra alkalmazott közeg megválasztása a szakember számára nem okoz nehézséget. A megfelelő védőhatású, legyengített coronavírusszerű vírus-vakcinát oly módon nyerjük, hogy a 50 tisztított vírust annyiszor oltjuk át magzati borjú-vesesejt-tenyészeteken, amennyi átoltás elegendő ahhoz, hogy az ilyen vírussal beoltott borjakon a virulens vírus már ne okozzon megbetegedést. Általában 5—60 átoltás szükséges erre a célra; az áltoltásokat primer 55 vagy szekunder sejteken (az utóbbiakon oly primer sejteket értünk, amelyekkel már előzőleg végeztünk egyszeri átoltást), vagy pedig már többszöri átoltással kezelt sejteken végezzük. Előnyösen oly módon járunk el, hogy a sorozatos átoltásokra primer vagy ^Q szekunder sejteken (az utóbbiakon oly primer sejteket értünk, amelyekkel már előzőleg végeztünk egyszeri átoltást), vagy pedig már többszöri átoltással kezelt sejteken végezzük. Előnyösen oly módon járunk el, hogy a sorozatos átoltásokra primer vagy 65 szekunder sejteket és már többszöri átoltással is kezelt sejteket kombináltan alkalmazunk. Az eljárás során a vírus-titereket a szokásos, ismert módszerekkel határoztuk meg. így például a hígított vírussal beoltott sejteket 5 napig inkubáljuk a magzati borjúvesesejteket tartalmazó kémcsövekben. A vírus jelenlétét például ismert virológiái módszerekkel kimutatható citopatológiai hatások, immunofluoreszcenda vagy hemadszorpció alapján határozzuk meg. A hatásos legyengített vakdna előállítási eljárását az alábbiakban példaképpen részletesen ismertetjük: A borjú-magzatból nagymennyiségű primer vesesejtet különítünk el. A primer sejtekből néhány palackozott és mikroszkóp-fedőlemez- kultúrát készítünk, a megmaradt primer sejteket pedig egy 0,5% laktalbumin-hidrolizátumot, 10% szarvasmarha-szérumot és 10% dimetil-szulfoxidot tartalmazó, pufferezett Earle-féle sóoldatban megfagyasztjuk. Az említett mindkét fajta kultúrát beoltjuk a fentebb leírt módon, akár közvetlenül a hasmenéses borjú faeceséből, akár előzetesen tenyésztett borjú-vesesejt kultúrából kapott vírustartalmú folyadékkal, majd 37°C hőmérsékleten inkubáltatjuk. Amikor már néhány fluoreszcens sejtet figyelhetünk meg a fedőlemez-kultúrákon, akkor az ugyanazon magzatból származó primer vesesejtek fagyasztott készítményéből néhány primer sejtet felengedni hagyunk és a szokásos módszerrel egysjetréteges sejtkultúrát készítünk belőlük, A fertőzött primer sejtkultúrából származó folyadékot rávisszük ezekre a szekunder sejtkultúrákra. 6-7 napig inkubáltatjuk, majd a szekunder sejtkultúrából származó folyadékot további szekunder sejtkultúrák beoltására használjuk fel. Ezt az eljárást többször megismételjük; az 1.-15. átoltás során 2 ml folyadékot hasznáunk fel a 250 ml-es palackokban a fenti módon elkészített sejtkultúrák beoltására. A 15.-25. passzázs során 2 ml folyadékot adunk a palackban levő sejttenyészet-fenntartó közeghez. A 25. passzázs után már csak 1 ml inokulumot adunk minden egyes palackhoz. Ha a coronavírus-szerű vírus már 5—20 sejtkultúraátoltáson ment keresztül, akkor egy újabb passzázs-sorozatot kezdünk szekunder sejtekből készített kultúrákon. Mindegyik vírus-passzázsnál csupán a sejtek egy része fertőződik;- a többi, fertőzetlen sejtet másodlagos kultúrában tenyésztjük tovább, hogy ezeket is a következő sejtpasszázs-szintre hozzuk. Az ilyen típusú sejtkultúrát „passzázsolt sejtkultúrának" nevezzük. A vírusnak a passzázsolt sejtkultúrákon történő további másodlagos kultúrákban történő sorozatos. passzázsokban való átoltása útján egy összeférő sejtvírus-rendszert fejlesztünk ki. A másodlagos sejtkultúrákban történő 5—20 passzázs után a vírust további 5^40 vagy ennél is több passzázson visszük keresztül a passzászolt sejtkultúrákon, hogy így hatásos legyengített coronavírus-szerű vírus-vakcinát állítsunk elő. Az inkubációs idő a vírus-passzázsok során a passzázsok növekvő számával csökken; általában 2-7 nap lehet ez az inkubációs idő a passzázsolt sejtkultúra magasabb fokozataiban. Minden egyes passzázs-sorozatot addig folytatunk, amíg ismert virológiái módszerekkel kimutatható dtopatogén hatás nem jelentkezik. A vakcinát azután magzati borjúvese-sejteken vagy más, borjakból származó vagy egyéb eredetű sejteken, például borjútüdő-, borjú-orrkagyló- vagy sertésvese-sejteken készítjük, olymódon, hogy a kultúrát 47°C körüli hőmérsékleten addig inkubáljuk, amíg megfelelő vKus-titert nem érünk el, azután a