168486. lajstromszámú szabadalom • Eljárás coronavírus-szerű borjú-hasmenés-virus legyengítésére, valamint a legyengített vírust tartalmazó készítmény, főként vakcina előállítására
9 168486 10 vírust elkülönítjük. 102 -106,5 nagyságrendű, előnyösen 104 —10 6 nagyságrendű vírus-titert érünk el. Az így elkészített vakcinát azután folyékony állapotban vagy liofilizált alakban használhatjuk fel. Utóbbi esetben a készítményt steril hígítószerrel, például steril desztillált vízzel hozzuk folyékony állapotba felhasználás előtt. Előnyös tulajdonságokat mutató legyengített vírust kapunk, ha a vírust 12 passzázson visszük át másodlagos sejteken, majd 15 passzázson olyan sejtkultúrán, amelyet magát is már 9—27 passzázson vittünk keresztül. A teljes passzázs-szint így 27 volt. Készítettünk vakcinákat egészen 35 passzázsig menő művelettelis. Emellett hatásos inaktívált vakcinát is készítünk, a coronavírus-szerű hatóanyag inaktiválása útján. Ezt általában oly módon készítjük, hogy a hatóanyagot először magzati borjúvese-sejteken tenyésztjük a fent leírt módon, mregfelelő titer eléréséig. Ez a titer a fentebb említett nagyságrendű lehet. Bármilyen paszszázs-szintű vírust alkalmazhatunk erre a célra, akár legyengített vírust is. Ezután a vírus inaktiválását olymódon érjük el, hogy a vírust 20—40°C hőmérsékleten valamely, a szakmában ismert inaktíváló szerrel vagy módszerrel kezeljük, például formaiinnal, bétapropiolaktonnal, ibolyántúli besugárzással vagy hőkezeléssel; a kezelés időtartamát illetőleg a kezelő szer koncentrációját oly módon választjuk meg, hogy hatásos inaktiválást érjük el. Az ilyen eljárás részletei a szakmabeliek számára jól ismertek. Alkalmazhatunk segédanyagokat is, az antigén-hatás növelése érdekében. Az ilyen segédanyagok is jól ismertek a szakmabeliek előtt: alkalmazható ilyen célra például alumínium-hidroxid gél, kálium-timsó, alginátok, olajok vagy más ásványi vagy szerves olajszerű segédanyagok. Az inaktívált vakcina előállítási módját közelebbről az alábbi jellegzetes példával szemléltetjük: 27. passzázs-szintű coronavírus-szerű hatóanyagot alkalmazunk, amelyet a fentebb ismertetett módon készítettünk. A vírust tartalmazó kultúra-folyadékhoz formaiint adunk, 0,2% formaldehid-koncentráció eléréséig. Az így kezelt folyadékot azután 1—2 napig állni hagyjuk 37°C hőmérsékleten. Az így inaktívált vírushoz alumínium-hidroxid gélt adunk segédanyagként, 10% koncentrációban. A készítmény pH-értékét alumíniumhidroxiddal körülbelül 7,2-re állítjuk be. A találmány szerinti eljárással készített legyengített vakcinát orálisan adhatjuk be, 1—5 ml adagokban, amelyek ÍO^-IO6 ^ 1 TCID/ml hatóanyagot (TCID = a sejtkultúrát megfertőző minimális adag) tartalmaznak. A készítménnyel a borjakat előnyösen közvetlenül születésük után kezeljük, hogy így biztosítsuk a borjak immunitását a virulens vírussal szemben. Az in aktivált vakcinát parenterális úton adjuk be 1—5 ml adagban, vemhes teheneknek, szülés előtt 30—90 nappal, vagy pedig az újszülött borjaknak, amilyen hamar az születés után lehetséges, hogy így biztosítsuk az újszülött borjak védelmét a coronaví- 60 rus-szerű hatóanyaggal szemben. Emellett készíthetünk kombinált vakcinát is, amely coronavírus-szerű vírus-hatóanyagot és bármilyen egyéb, előnyösen inaktivált vírust tartalmaz, így kombinát immunizáló hatást érhetünk el borjakon illetőleg teheneken. Egy 65 előnyös kombináció inaktivált coronavírus-szerű vírust és reovírust tartalmaz: mindkettő az eleven vírus inaktiválása útján állítható elő. Kiindulási anyagként akár gyengítetlen, akár gyengített vírust alkalmazhatunk és az inaktiválást vegyszeres kezeléssel, besugárzással vagy hőkezeléssel érjük el, a fentebb már említett módon. A coronavírust-szerű vírust kombi-5 nálhatjuk borjú-adenovírussal, borjú-hasmenés-yírussal, vagy egyéb, a szarvasmarhákra parogen organizmussal, például Escherichia coli vagy Clostridium fajokkal. A coronavírus-szerű vírust és reovírust tartalmazó 10 kombinált vakcinát oly módon készítjük, hogy a kétféle inaktivált vírust egyenlő mennyiségi arányban elegyítjük. Ezután formaiint adunk hozzá 0,2% formaldehid-koncentráció eléréséig, továbbá 10% alumínium-hidroxid gélt. 15 Az így elkészített vírust parenterális úton adhatjuk be vemhes teheneknek 1—5 ml adagokban. Adható az ilyen kombinát vírus borjaknak is. Az ilyen kombi"nált vírus alkalmazásával az újszülött borjaknak colostrum- és/vagy tej-antitestek képzése útján nyújtunk 20 védelmet. Emellett védelem érhető el mindkét hatóanyaggal szemben olymódon is, hogy a vemhes teheneket inaktívat reovírus-szerű vakcinával immunizáljuk, azután az újszülött borjaknak adunk legyengített coronavírus-szerű vakcinát. Ugyancsak biztosíthatunk 25 védelmet midnkét hatássá szemben oly módon is, hogy a vemhes tehenet az inaktivált coronavírus-szerű vakcinává immunizáljuk, majd az újszülött borjaknak legyengített reovírus-szerű vakcinát adunk. Adhatunk továbbá hasonló eredménnyel legyengített corona-30 vírust és reovírus-szerű hatóanyagot egyaránt tartámazó kombinát vakcinát is a vemhes teheneknek. A legyengített vírus-vakcina hatásosságát oly módon vizsgáltuk, hogy a különböző sejtkultúrapasszázs szintekkel készített vakcinát a születés után körülbe-35 lül 7 órával adtuk be gnotobiotikus újszülött borjaknak. Később azután a borjakat virulens vírussá történő beoltás útján fertőztük. Az így lefolytatott kísérletek során kapott eredményeket az áábbi I. táblázatban fogiájuk össze. 40 A táblázatban összefoglát kísérleteket az áábbiakban ismertetjük közelebbről: Az 1. sz. borjút oráis úton kezeltük 10 ml oly sejtkultúra-folyadékká, amelyet a vírus magzati bor-45 júvese-sejtek másodlagos kultúráján 14 passzázs útján kaptunk. A borjún a hasmenés kialakult, de az álat meggyógyult, 9 napos korában a borjút oráis úton virulens vírussá fertőztük, amelyet lOmlhasmenéses borjúból kapott ürülék 20 ml foszfát-puffer tartamú 50 NaCl-oldattal készített szuszpenziója alakjában alkámaztunk. A borjú a fertőzés ellenére egészséges maradt. A 2. sz. borjút 10 ml oly vakcinává oltottuk be, amelyet másodlagos magzati borjúvese-sejtkultúrán lefolytatott 15 passzázs útján alítottunk elő. A borjú egészséges maradt, hasmenés nem mutatkozott. Virulens vírussá az előzőkben ismertetett módon történő fertőzés után sem lépett fel megbetegedés. A 3. és 4. sz. borjút 10 ml vakcinává oltottuk be, amelyet másodlagos magzati borjúvese-sejtkultúrán történő 16 passzázs útján állítottunk elő. A borjakon enyhe hasmenés mutatkozott. A borjak közül a 3. számút a hasmenés fellépése után rövid idővel levágtuk és megvizsgáltuk a beleit: a vékonybélből és a vastagbélből vett metszeteket a coronavírus-szerű hatóanyag konjugátumává megfestettük és így a bélbolyhok epitheliumában, váamint a vastagbélből \
