168434. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a módosított szerkezetű emberi adrenokortikotróp hormon és fragmensei előállítására
13 168434 14 5,2 g (6,7 mmól) védett H-28-32-OtBu-t 2,15 g (6,7 mmól) Z-Ala-ONSu-val 50 ml kloroformban oldva reagáltatunk. A reakcióelegyet másnap 3X10 ml sósavoldattal, 3X10 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel kirázzuk. Szárítás után a kloroformot ledesztilláljuk és a maradékot petroléterrel szűrőre visszük, majd szárítjuk. Kitermelés: 6,1 g (93,1%) védett Z-27-32-OtBu. Op.: 194-195 °C; 1^:0,5; [a]D = 30,9° (c=l;etanol). Elemzés a C47 H w 0 16 N 6 (M: 979,14) összegképlet alapján: számított: C 57,7%; H 7,6%; N8,6%; talált: C57,6%; H 7,7%; N8,5%. 8. lépés H-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-27-32-OtBu) 6,1 g (6,2 mmól) Z-27-32-OtBu-t oldunk 120 ml metanolban, és 1 g 10%-os csontszenes palládium jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot etanol-éter elegyéből kristályosítjuk. Kitermelés: 4,35 g (83%) védett H-27-32-OtBu. Op.: 192-194 "CjR1 / : 0,25;R|: 0,1. Elemzés a C39 H68 N 6 0 M (M: 845,0) összegképlet alapján: számított: C 55,4%; H 8,1%; N9,9%; talált: C55,2%; H 7,8%; N9,6%. 9. lépés Z-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)- Ser-Ala-OtBu (védett Z-25-32-OtBu) 2,45 g (13,3 mmól) pentafluorfenolt, 1,31 g(4,02 mmól) Z-Asn-Gly-OH-t (1. példa) és 3,4 g (4,02 mmól) védett H-27-32-OtBu-t 24 ml száraz DMF-ben oldunk, majd az oldatot 0 C°-ra hűtjük és 0,915 g (4,43 mmól) DCC-t adunk hozzá. A reakcióelegyet fél órán át 0 C°-on, 2,5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. A szilárd maradékot etil-acetáttal eldolgozva szűrjük, és forró etil-acetáttal mossuk, majd szárítjuk. Kitermelés: 4,12 g (89%) védett Z-25-32-OtBu. Op.: 200-201 °C. R3 ~ 0,6; [ak = -13,9° (c=l; DMF). 10. lépés H-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu (OtBu)-Ser-Ala-OtBu (H-25-32-OtBu) 4,0 g (3,48 mmól) Z-25-32-OtBu-t 140 ml metanolban pldunk és 0,5 g 10%-os csontszenes palládium jelenlétében hidrogénezünk. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük, majd szűrjük, szárítjuk. Kitermelés: 3,4 g (96%) védett H-25-32-OtBu. Op.: 188-190 °C. RÍ: 0,5; [ak = -6,6° (c=0,89;DMF). 11. lépés Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(N02 )-Arg(N0 2 )-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu (védett Z-15-32-OtBu) 3,0 g (2,95 mmól) védett H-25-32-OtBu-t és 5,46 g (2,95 mmól) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(N02)-Arg(N02)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH-t (155 254 és 155 880 számú magyar szabadalmi leírások) 33 ml DMF-ben oldunk, az oldatot 0 C°-ra hűtjük és hozzáadunk 3,35 g (4,42 mmól) DCC-PFPOH komplexet. A reakcióelegyet 15 percig 0 C°-on tartjuk, majd hat órán át szobahőmérsékleten. Ezután a DCU-t kiszűrjük úgy, hogy a szüredéket 450 ml száraz éterbe engedjük. A kivált nyersterméket 5 szűrés után metanol-éter elegyből átkristályosítva tisztítjuk. Kitermelés: 7,18 g (85,1%) védett Z-15-32-OtBu. Rl: 0,35; [ak = -26,4° (c=0,43; DMF). 10 12. lépés H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg(N02 )-Arg(N0 2 )Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBU)-ProAsn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-OtBu-3HCl (védett H-l 5-32-OtBu)-3HCl 6,5 g (2,28 mmól) védett Z-l 5-32-OtBu-t 85 ml 15 ecetsavban oldunk és 2 g 10%-os csontszenes palládium jelenlétében hidrogénezzük. A reakciót vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatokkal ellenőrizzük. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük, a szűrletet szárazra pároljuk és az olajos maradékot száraz éterrel 20 megszilárdítjuk. Szűrés után a terméket 70 ml vízben oldjuk és az oldat pH-ját híg sósavoldattal 4-re állítjuk. Ezután a terméket az oldatból 30%-os nátrium-klorid-oldattal kicsapjuk. Szűrés és szárítás után a terméket metanol-kloroform elegyben oldva, majd 25 szűrve sótalanítjuk. Az oldószer ledesztillálásával nyert maradékot éterrel eldörzsölve szűrjük, szárítjuk. Kitermelés: 5,6 g (89,6%) védett H-15-32-OtBu-3HCl. R*: 0,35; [ak = -26,1° (c=l; DMF). Aminosavanalízis: Lys 3,0(3); Arg 1,8(2); Asp 30 1,98(2); Ser 1,0(1); Glu 2,2(2); Pro 2,1(2); Gly 1,05(1); Ala 2,0(2); Val 1,96(2); Tyr 0,96(1). 13. lépés BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg- Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VAl-Gly-Lys-35 (BOC)-Lys(BOO-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser-Ala-Ot-Bu-3HC1 (védett BOC-l-32-OtBu-3HCl) 3,11 g (1,57 mmól) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-40 (OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH-HCl-t (155 254 és 155 880 számú magyar szabadalmi leírások) és 4,30 g (1,57 mmól) védett H-15-32-OtBu-t 25 ml DMF-ben oldunk, az oldathoz 0,22 ml trietil-amint, majd 1,79 g (2,36 mmól) 45 DCC-PFPOH komplexet adunk. A reakcióelegyet 24 óráig szobahőmérsékleten keverjük, majd 300 ml száraz éterbe szűrjük. A kivált terméket szűrjük, mossuk, szárítjuk. Kitermelés: 7,2 g (98,5%) védett BOC-l-32-OtBu-3HCl. R*: 0,5; [ak = -27,6° (c=l; 50 DMF)-14. lépés H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-55 Ser-Ala-3CH3COOH (H-l-32-OH-3CH 3 -COOH) 3,0 g (0,64 mmól) védett BOC-l-32-OtBu-3HCl-t keverés közben feloldunk 3,0 ml anizol, 3,0 ml víz, 24 ml trifluorecetsav elegyében. Egy órai keverés után 60 a reakcióelegyhez 300 ml étert öntünk, a kivált csapadékot szűrjük, és mossuk éterrel. A kapott trifluor-acetátot (2,86 g) vízben oldva lOOmlDowex lx—8 (Röhm and Hass-cég) ioncserélő gyantán acetáttá alakítjuk, majd a vizes oldatot 500 ml CM 23-ból 65 (Whatmann-cég) készült oszlopra visszük. Az oszlop-7
