168434. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a módosított szerkezetű emberi adrenokortikotróp hormon és fragmensei előállítására
9 168434 10 oldunk, az oldatot 0 C°-ra hűtjük, és 3,64 g (4,8 mmól) DCC-PFPOH komplexet, mely a reaktánsokat 1:3 arányban tartalmazza, szórunk bele. A reakcióelegyet 20 percig 0 C°-on, majd 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a reakcióelegyet 300 ml 5 száraz éterbe szűrjük és a kivált csapadékot szűréssel . elkülönítjük. A nyerstermék súlya: 11,0 g (97%), op.: 180 °C. A nyersterméket 33 ml metanolban oldjuk és 430 ml etil-acetát hozzáadásával leválasztjuk. Kitermelés: 8,75 g (77%) védett Z-15-31-OtBu. Op.: 185 10 °C (bomlik); Rf: 0,5. 14. lépés H-Lys(BOC-Lys)BOC(-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu(OtBu) -Asp(OtBu)-Glu(OtBu)~Ser(tBu)-Ot- j 5 Bu-3HC1 (védett H-15-31-OtBu-3HCl) 6,5 g (2,5 mmól) védett Z-15-31-OtBu-t oldunk 85 ml ecetsavban, és 2 g 10%-os csontszenes palládium jelenlétében hidrogéngázt buborékoltatunk át rajta. A reakció előrehaladását vékonyréteg kromatográfiás 20 vizsgálatokkal ellenőrizzük. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. Az így nyert terméket (6,27 g) 70 ml vízben oldjuk és az oldat pH-ját hűtés közben híg. sósavoldattal 4-re állítjuk. Ezután az oldathoz 20 ml 30%-os nátrium- 25 klorid-oldatot adunk, majd a kivált csapadékot szűrjük és szárítjuk. A sótalanítás úgy történik, hogy a terméket etanolban és kloroformban szuszpendálva, a sót kiszűrjük, a szűrletet szárazra pároljuk és a maradékot éterrel eldolgozva szűrjük. Kitermelés: 5,35 30 g (85,6%) védett H-l5-31-OtBu. 3HC1. R?: 0,45. 15. lépés BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp- Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Arg- Arg-Pro-Val-Lys- 35 (BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-Asn-Gly- Ala-Glu(OtBu)-Asp-OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Ot-Bu-3HC1 (védett BOC-l-31-OtBu-3HCl) 2,96 g (1,5 mmól) BOC-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu( Ot Bu) -H is -Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly- 40 OH (155 254 és 155 880 számú magyar szabadalmi leírások) és 4,0? g (1,5 mmól) védett H-l 5-31-Ot-Bu-3HCl-t oldunk 20 ml DMF-ben, az oldatot 0 C°-ra hűtjük és először 0,21 ml trietil-amint, majd 1,36 g (1,8 mmól) DCC-PFPOH komplexet adunk hozzá. A 45 reakcióelegyet 10 percig 0 C -on, majd 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, végül 250 ml száraz éterbe szűrjük. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk. Kitermelés: 6,84 g (98,4%) védett BOC-l-31-OtBu-3HCl;Rj:0,45. 50 16. lépés H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-OH-3CH3COOH (H-l-31-OH-3CH3- 55 COOH) 3,0 g (0,647 mmól) védett BOC-l-31-OtBu-3HCl-t oldunk 30 ml, trifluorecetsav:víz:anizol = 8:1:1 arányú elegyében és az oldatot 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az oldathoz 300 ml étert 6C adunk, a kivált csapadékot szűrjük és éterrel mossuk. A kapott trifluor-acetátot (2,89 g) vízben oldva Dowex IX-8 acetátanion cserélő műgyantán (Rohmand Haas cég) átbocsátjuk, majd az oldatot 500 ml CM 23-ból (Whatmann-cég) készült oszlopra visszük. 65 A tisztítást gradiens elúcióval végezzük, eluensként 1500-1500 ml 0,01-0,5 mólos (pH 4,5-6,7) ammónium-acetát-oldatot használunk, az átfolyási sebesség 115,7 ml/óra, 110 28 ml-es frakciót gyűjtünk össze, a főterméket a 65-71. frakciók tartalmazzák. A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. Kitermelés: 1,64 g (70%) vékonyréteg kromatográfiásan egységes, H-1-31-OH. R\s : 0,18. Aminosavanalízis: Lys 4,08(4); His 1,0(1); Arg 2,94(3); Asp 2,01(2); Met 0,78(1); Ser 2,78(3); Glu 3,07(3); Pro 2,86 (3); Gly 2,97(3); Ala 1,09(1); Val 2,95(3); Tyr 2,1(2);Phe 1,09(1). 2. példa Az emberi ACTHx _ 31 színtézise 1. lépés Z-Arg(N0 2)-Arg(N0 2 )-Pro-OPFP (védett Z-17-19-OPFP) 3,26 g (5 mmól) Z-Arg(N02)-Arg(N0 2 )-Pro-OH-t 6 155 254 számú magyar szabadalmi leírás) oldunk 30 ml DMF-ben és az oldathoz 5,31 g (7 mmól) DCC-PFPOH komplexet adunk. A reakcióelegyet 5 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a kivált DCU-t szűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradék olaj éterben megszilárdul. A csapadékot szűrjük, éterrel mossuk. Súlya: 3,8 g (92,9%). A nyersterméket 11 ml tetrahidrofuránban oldjuk és 60 ml éterrel leválasztjuk, szűrjük, szárítjuk. Kitermelés: 3,42 g (83,6%) védett Z-17-19-OPFP; R1*: 0,55. Elemzés a C31 H 36 Oi 0 Nu Fs (M: 817,09) összegképlet alapján: számított: N 18,8%. talált: N 18,6%. 2. lépés Z-Arg(N02 )-Arg(N0 2 )-Pro-Val-Lys(BOC)Val- Tyr(tBu)-Pro-OH (védett Z-17-24-OH) 2,22 g (2,92 mmól) H-Val-Lys-(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH-t (155 254 számú magyar szabadalmi leírás) 25 ml DMF-ben szuszpendálunk és keverés közben hozzáadunk 2,64 g (3,22 mmól) Z-17-19-OPFP-t. 2,5 órai szobahőmérsékleten történő keverés után tiszta oldatot nyerünk, melyet további 2,5 órai keverés után szárazra párolunk. A maradékot tetrahidrofuránban szűrőre visszük, majd tetrahidrofuránnal mossuk. A nyersterméket (3,8 g; 93,3%) 15 ml metanolban oldjuk, és 100 ml etil-acetátot adunk hozzá. A kivált csapadékot szűrjük, szárítjuk. Termelés: 3,55 g (87,2%) védett Z-17-24-OH. Rf. 0,7. 3. lépés H-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)Pro- OH-3HC1 (védett H-17-24-OH-3HC1) 0,4 g (0,29 mmól) védett Z-17-24-OH 8 ml ecetsavas oldatát 0,1 g 10%-os csontszenes palládium jelenlétében hidrogénezzük. A reakció előrehaladását vékonyréteg kromatográfiásan ellenőrizzük, majd a reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradék olajat 3 ml metanolban oldjuk és áz oldat pH-ját hűtés közben híg sósavoldattal 4-re állítjuk. Ezután az oldatot szárazra pároljuk és a párlási maradékot etil-acetáttal szűrőre visszük, majd szárítjuk. Kitermelés: 0,26 g (70,2%) védett H-l 7-24-OH • 3HC1. Rj: 0,1. 4. lépés Z-Lys(BOC)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr(tBu)-Pro-OH-2HCl (védett Z-16-24-OH-2HC1) 5
