168434. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a módosított szerkezetű emberi adrenokortikotróp hormon és fragmensei előállítására
168434 5 6 ACTH 1-14 tetradekapeptidet a 15-31 heptadekapeptiddel, a 15—32 oktadekapeptiddel vagy a 15-39 pentakozapeptiddel a fenti reakciókörülmények között reagáltatjuk. A Helv. Chim. Acta 54, 897 (1971) cikk szerint az ACTH 1-24 előállítása mindössze 43%-os kitermeléssel valósítható meg. Ugy is eljárhatunk, hogy a Z-Alg(N02 )-Arg(N0 2 )Pro-OH-ból előállított pentafluor-fenilészterrel acilezzük a H-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-(tBu)-Pro-OH pentapeptidet, a kapott oktapeptidet katalitikusan hidrogénezzük, amikor is az arginin guanidinocsoportjának védésére szolgáló nitrocsoportokat is eltávolítjuk, és lépésenként építjük fel a védett 15—24 dekapeptidet, amely a védett 15—24 dekapeptidtől abban különbözik, hogy az arginin guanidinocsoportjai protonáltak. Ennek előnye az, hogy a savérzékeny védőcsoportokat tartalmazó C-terminális peptideket nem kell alávetnünk annak a katalitikus hidrogénezésnek, mely egyúttal a nitrocsoportok eltávolítására is szolgál, és ecetsavas közegben hosszú — esetleg több napos — reakcióidőt igényel. A védett közti termékek különleges, például oszlopkromatográfiás tisztítására nincs szükség, elegendő a védőcsoportoktól megszabadított végtermék tisztítása. Ez történhet ellenáramú megoszlás elve alapján, oszlopkromatografálással, például karboximetil-cellulózon stb. A példákban használt rövidítések a IUPAC-IUB által elfogadottak [J. Biol. Chem. 247, 977 (1972)]. További rövidítés a címszavak utáni zárójeles szimbólum, mely a szekvenciarész számokkal történő megadását, továbbá az N-terminális és C-terminális végcsoportokat jelzi. Az oldalláncok védőcsoportjai a címszóban találhatók, és a rövidítésben „védett" utalás szerepel. Egyéb rövidítések: DCC=diciklohexilkarbodiimid, DCU=diciklohexil-karbamid, PFPOH= pentafluorfenol, PCPOH=pentaklórfenol, DCHA=diciklohexil-amin. Az olvadáspont meghatározások dr. Tottoli-féle (Büchi, Schweiz) készülékben történtek. A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatokat „Silicagel nach Stahl" (Merck-cég) adszorbensen végeztük az alábbi oldószer elegyekben: 1. etilacetát-(piridin-ecetsav-víz=20:6:ll) = = 95:5 2. etilacetát-(piridin-ecetsav-víz=20:6:ll) = = 9:1 3. etÜacetát-(piridin-ecetsav-víz=20:6:l 1) = = 4:1 4. etilacetát-(piridin-ecetsav-víz=20:6:ll) = = 3:2 5. etilacetát-piridin-ecetsav-víz= 240:20:6:11 6. etilacetát-piridin-ecetsav-víz= 120:20:6:11 7. etilacetát-piridin-ecetsav-víz= 60:20:6:11 8. etilacetát-piridin-ecetsav-víz= 3020:6:11 9. etilacetát-piridin-ecetsav-víz= 48020:6:11 10. kloroform-hexán-ecetsav= 8:1:1 11. kloroform-metanol= 98:2 12. kloroform-metanol= 95:5 13. kloroform-metanol= 9:1 14. kloroform-metanol= 85 '5 15. n-butanol-piridin-ecetsav-víz= 30:20:6:24 16. Horoform-metanol-ecetsav= 8:1:1 Az előhívás ninhidrinnel és/vagy klór+tolidinnel történt. 1. példa . Az emberi ACTHi _3i szintézise 1. lépés Z-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu (védett Z-30-31-OtBu) 5 10,85 g (25 mmól) Z-Glu(OtBu)-ONSu-t oldunk 100 ml etil-acetátban és az oldatba beleszórunk 7,0 g (27,5 mmól) H-Ser(tBu)-OtBu«HCl-t. A kapott szuszpenziót 0 C°-ra hűtjük és keverés közben 3,85 ml (27,5 mmól) trietil-amint adunk hozzá. A reakcióele-10 gyet fél óra hosszat 0 C°-on, majd éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük és 2X20 ml n sósavoldattal, 3X20 ml n nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és végül vízzel kirázzuk. Az etilacetátos oldatot szárítás után szárazra pároljuk és a maradék olajat 15 petroléterrel eldörzsöljük, szűrjük és szárítjuk. így 10,45 g (77,8%) védett Z-30-31-OtBu-t nyerünk. Op.: 92-95 °C;RV :0,8. Elemzés a C28H44O8N2 (M: 536,68) összegképlet alapján: 20 számított: C 62,7%, H 8,3%; talált: C 62,4%, H 8,2%. 2. lépés H-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-OtBu (védett H-30-31-OtBu) 25 17,2 g (32 mmól) védett Z-30-31 OtBu-t feloldunk 350 ml metanolban és 2,5 g 10%-os csontszenes palládium jelenlétében 1 órán át hidrogéngázt buborékoltatunk át az oldaton. A katalizátor kiszűrése után a szűrletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és 30 a szilárd maradékot petroléterrel szűrőre visszük és a szűrőmaradékot megszárítjuk. Kitermelés: 10,97 g (83,4%) H-Glu(OtBu)Ser(TBu)-OtBu. Op.: 78-82 "CR1/ :0,4. Elemzés a CM^gOeNj (M: 402,54) összegképlet 35 alapján: számított: C 59,7%, H9,5%, N 6,9%; talált: C59„8%, H9,4%, N 6,6%. 3. lépés Z-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)Ser(tBu)-OtBu (védett Z-29-31-OtBu) 40 9,45 g (22,5 mmól) Z-Asp(OtBu)-ONSu-t és 10,1 g (25 mmól) védett H-30-31-OtBu-t 200 ml etil-acetátban oldva egy éjszakán át állni hagyjuk, majd az oldatot 2X50 ml n sósavoldattal, 3X50 ml n nátriumhidrogén-karbonát-oldattal, és végül vízzel kirázzuk. 45 Az etil-acetát ledesztillálása után nyert olajat víz hozzáadásával megszilárdítjuk, szűrjük és szárítjuk. így 15,2 g (95,0%) védett Z-29-31-OtBu-t nyerünk. Op.:84-87°C;R1 f 1 :0,70. Elemzés a C* H57 O n N 3 (M: 707,88) összegképlet 50 alapján: számított: C61,l%, H8,l%; talált: C61,3%, H 8,3%. 4. lépés Z-Glu(0tBu)-Asp(0tBu)-Glu(0tBu)3er(tBu)OtBu (védett Z-28-31-OtBu) 55 14,18 g (20 mmól) Z-29-31-OtBu-t 280 ml metanolban oldva 2,1 g 10%-os csontszenes palládium jelenlétében félórán át hidrogénezünk. A katalizátor kiszűrése után nyert oldatot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és a maradék olajat (11,65 g; R" : 60 0,2) 8,25 g (19 mmól) Z-Glu(OtBu)-ONSu-val reagáltatjuk 200 ml etil-acetátban oldva. Az oldatot éjszakán át állni hagyjuk, majd kirázzuk 2X50 ml n sósavoldattal, 3X50 ml n nátrium-hidrogén-karbonátoldattal, és végül vízzel. Szárítás után az etil-acetátot 65 ledesztilláljuk és a szilárd maradékot n-hexánnal
