168425. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az M 102 jelű metánt oxidáló baktériumtörzs nagy aktivitású tiszta tenyészetének előállítására
5 168425 6 Mn (MnS04 • 5 H 2 0 alakjában) 10 jug Zn (ZnS04 • 7 H2 0 alakjában) 70 jug Mo (Mo03 alakjában) 10 jug KCl 0,04 g CaCl2 0,015 g ionmentes víz 1 liter A dúsítási tenyészet képződését és növekedését a fent megadott ásványi anyag-tápoldatban szokásos módszerekkel ellenőrizhetjük és követhetjük pl. úgy, hogy ismert fotóméterben 420 nm hullámhosszon mérjük a baktériumtartalmú tápoldat zavarosságát. Jelentős zavarosodást általában 1 napos kezelés után észlelhetünk. Több nap elteltével dús baktériumnövekedés lép fel, amely zavarosságméréssel, valamint makroszkópos és mikroszkópos észleléssel egyaránt kimutatható. Ezután a kapott dúsított baktériumtenyészet mintáit kenet formájában ásványi anyag-agar-táptalajon tovább tenyésztjük. Táptalajként előnyösen pl. 1,5% agart, így un. „Bacto-Agar"-t tartalmazó fenti típusú ásványi anyag-tápoldatot alkalmazunk. A 'cenet formájában felvitt mikroorganizmus az ásványi anyag-agar táptalajon mikrotelepeket képez, amelyek szabad szemmel nem észlelhetők és csak nagyítóval vagy mikroszkóppal válnak láthatóvá. Ez a szokatlan növekedéstípus a találmány szerinti eljárásban felhasznált M 102 baktériumtörzs egyik fontos megkülönböztető jegye. A : mikrotelepek összhatása és megjelenési formája alapján a szakember számára nyilvánvaló, hogy egységes populáció képződik. Ezután a képződött baktérium-telepekből ismert módon, pl. kereskedelemben kapható ún. mikromanipulátor segítségével sejtegységeket különítünk el. Az elkülönített sejtegységeket úgy szaporítjuk, hogy a sejteket tápoldat-cseppekben, előnyösen a korábbiakban ismertetett ásványi anyag-tápoldat cseppjeiben kb. 1:1 arányú metán-levegő gázeleggyel kezeljük. Ekkor a tápoldat-cseppekben tiszta baktériumtenyészetek képződnek, amelyeket ismert módon különítünk el. A kapott tiszta baktériumtenyészetek tisztaságát előnyösen további kenet-tenyésztéssel ellenőrizzük. Az ellenőrző vizsgálatok eredményei egyértelműen azt igazolják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított, metánt oxidáló baktériumtörzs az ismert, és az ilyen célokra általánosan alkalmazott kritériumok - pl. növekedés szilárd felületen, biokémiai vizsgálatokban észlelt reakciók, fény- és elektronmikroszkópos megjelenés, stb. — alapján tiszta tenyészetnek mondható. A találmány szerint előállított metánt oxidáló M 102 baktériumtörzs különösen sajátságai következtében rendkívül előnyösen alkalmazható a metánból kiinduló fehérjeszintézisben. Elektronmikroszkópos vizsgálataink szerint az M 102 törzsbe tartozó baktériumok pálcika-alakúak, amelyeket egy többé-kevésbé széles nyákréteg vesz körül. . Fotomikroszkópos vizsgálatainkban azt találtuk, hogy az M 102 törzsbe tartozó baktériumok a nyákréteg szélességétől függően szabadon mozognak vagy összetapadnak. Ha az egyes baktériumokat viszonylag kevésbé széles nyákréteg veszi körül, a baktériumok szabadon mozognak, míg ha az egyes baktériumokat körülvevő nyákréteg viszonylag széles a baktériumok egymáshoz tapadnak. A baktériumok hossza kb. 1,5 mikron, szélessége kb. 0,8 mikron. 5 Az 1. ábrán feltüntetett növekedési görbét a 3. példában részletesen tárgyijuk. Az M 102 baktériumtörzset 1971. március 31-én PM 102/71 számon helyeztük letétbe a Stammsammlung der Mikrobiologischen Abteilung des Ghemisch-10 Physiologischen Instituts der Johann-Wolfgang Goethe Universität (Frankfurt/Main) gyűjteményben. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük: 15 1. példa Az M 102 metánt oxidáló baktériumtörzs elkülönítésére a Schöhsee nyugati partszakaszának partközeli részéből (a Max Planck intézet limnológiai kutatótele-20 pének területére eső térségből) talajüledék-mintát veszünk. 1 g talajüledéket 50 ml, a korábbiakban ismertetett Kaserer-oldatba helyezünk. A felhasznált Kaserer-oldat literenként 1 ml fent megadott típusú Hoagland A—Z-oldatot tartalmaz. A baktériumtar-25 talmú ásványi anyag-tápoldatot ezután kb. 200 ml térfogatú fermentorban 27 °C hőmérsékleten 1 térfogatrész metánból és 1 térfogatrész levegőből álló gázeleggyel kezeljük, eközben a fermentort forgó rázógéppel rázzuk. A fenti műveleteket steril 30 körülmények között végezzük. Az elkülönítés módszerét lásd a Z.f. alig. Mikrobiologie 10, 17-36 (1970) szakcikkben. A kezelt tápoldatból naponta kétszer (reggel és este) mintát veszünk, és ismert típusú spektro-35 fotométerrel 420 nm hullámhosszon meghatározzuk a minták zavarosságát. 1 nap elteltével jelentős zavarosodást észlelünk. 3 nap elteltével dús baktériumnövekedés mutatható ki, amely már nemcsak zavarodásméréssel, hanem makroszkóposán, ül. mikroszkópo-40 san is észlelhető. A kapott dúsított baktériumtenyészetből ásványi anyag-agar táptalajra keneteket viszünk fel. A táptalaj a fentieknek megfelelő ásványi anyagtápoldatban 1,5% ún. Baoto-Agar elnevezésű agart tartalmaz gél 45 formájában. A táptalajt 5 napon át a fent megadott összetételű metán-levegő gázeleggyel kezeljük. Ekkor a táptalajon baktérium-mikrotelepek képződnek, amelyek csak erős nagyítóval vagy mikroszkóppal észlelhetők. A mikrotelepek összképéből arra követ-50 keztethetünk, hogy egységes populáció fejlődött ki. A kapott baktériumtenyészetből szokásos módon, ún. mikromanipulátor segítségével sejtegységenként különítünk el. Az elkülönített sejtegységeket a fenti összetételű ásványi anyagtápoldat 1 cseppjében 1 rész 55 metánból és 1 rész levegőből álló gázeleggyel kezeljük. Kb. 5 nap elteltével a tápoldat-cseppekbe helyezett sejtegységekből tiszta baktériumtenyészetek képződnek, amelyeket ismert módon elkülönítünk. Az anyagforgalom gázkromatográfiás elemzésével ki-60 mutatható, hogy 1 súlyrész metán kb. 0,8—0,9 súlyrész sejtanyagot képez. 2. példa Az 1. példában ismertetett eljárással előállított 65 baktériumtörzs növekedési jellemzőinek meghatáro-3
