168425. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az M 102 jelű metánt oxidáló baktériumtörzs nagy aktivitású tiszta tenyészetének előállítására
3 168425 4 természetes életterükből - ahol a baktériumok anyagcsere-feltételei adottak, metán és oxigén bőségesen rendelkezésre áll —, hanem az un. határ-életterükből különítjük el, ahol a baktériumok szabályos anyagcsere-feltételei oxigénhiány miatt nem állnak fenn. A találmány szerinti eljárással előállított, metánt oxidáló M 102 baktériumok gram-, savstabilitási-, spóra-, csilló- és tok-festési kísérletekben negatív reakciót adnak, ásványi anyag-agar táptalajon szabad szemmel nem látható, mikroszkóposán azonban észlelhető mikrotelepeket képeznek, és 1 súlyrész metánt — a száraz anyagra vonatkoztatva — kb. 0,8 súlyrész baktérium alakít át. A találmány szerint a fent megadott, metánt oxidáló M 102 baktériumtörzset nagy aktivitású tiszta tenyészet formájában oly módon állítjuk elő, hogy egy vizes határ-élettér — ahol a metánt oxidáló baktériumtörzs szabályos anyagcsere-feltételei oxigénhiány miatt nem állnak fenn — talajüledékét ásványi anyag-tápoldatban kb. 1:1 térfogatarányú metán-levegő eleggyel kezeljük, az ásványi anyag-tápoldatban képződött, feldúsult baktériumtenyészet kenetét ásványi anyag-ag r táptalajra visszük fel, az ásványi anyag-agar táptalajon képződött baktériumtelepekből sejtegységeket külömtünk el, a kapott sejtegységeket ásványi anyag-tápoldatban 1:1 térfogatarányu metánlevegő eleggyel szaporítjuk, és a képződött tiszta baktériumtenyészetet elkülönítjük. A találmány szerinti eljárás végrehajtására különösen alkalmasnak bizonyultak olyan vizes életterek talajüledékei, amelyekben ugyan a metán igen nagy mennyiségben fordul elő, azonban bizonyos bakteriális redukciós folyamatok eredményeként az oxigén gyakorlatilag teljes mértékben hiányzik. Az ilyen életterek oxigénkoncentrációjának meghatározását, ül. a redukáló baktériumok kimutatását ismert módszerekkel végezzük. A fenti típusú élettereket határ-élettereknek nevezzük. Mindeddig nyilvánvalóan nem ismerték fel a határ-életterek jelentőségét a meghatározott anyagcserét végző baktériumok elkülönítésében. A találmány szerinti eljárás megvalósítása során tehát elsőként vizsgáltuk mélyrehatóan a határélettereket. Szakember számára ismert (E.P. Odúm: „Fundamentals of Ecology", 3. kiadás, Saunders Co., Philadelphia, 1971, 302. és következő oldalak), hogy a metánt oxidáló baktériumtörzsek határ-életterei a következő alapvető sajátságokkal rendelkeznek: a) A határ-életterek oxigénhiányosak, amit a kis oxigénnyomás és az alacsony redoxpotenciál jelez (C.H. Mortimer, 1949; Underwater „soils", Review of Lake Sediments, J. Soil Sei. 1. kötet, 63—73. oldal). b) A határ-életterekben kénhidrogén fordul elő. c) A határ-életterekben nagymértékben fokozódik az anaerob baktériumok részaránya. d) Az üledék kötött víztartalma nagymennyiségű tápanyagot tartalmaz. e) A jelenlevő mikroorganizmusok erjedéses anyagcserét folytatnak. Az M 102 jelű, metánt oxidáló baktériumtörzs a találmány szerinti eljárással bármilyen földrajzi helyről beszerzett határ-élettérből tiszta tenyészet formájában különíthető el. Kísérleteink során a következő határ-életterekből elkülönített talajüledékeket vizsgáltuk részletesebben: 1. A Schönsee Plön melletti (Holstein) nyugati partszakaszának partközeli részéből (a Max Planck intézet limnológiai telephelyének közeléből) elkülönített talajüledék; 5 2. az újonnan képződött izlandi „Surtsey" vulkáni szigetről származó talajüledék; 3. a svédországi Vid önstern tó värnamoi partszakaszából elkülönített talajüledék; és 4. az északnémetországi, Kelet-holsteini tavak kör-10 nyezetéből elkülönített talajüledék. Különösen előnyösnek bizonyult a Schonsee Plön melletti (Holstein) nyugati partszakaszának partközeli részéből (a Max Planck intézet limnológiai telephelyének közeléből) elkülönített határ-élettér. A le-15 írásban e határ-élettér kezelését ismertetjük részletesen, megjegyezzük azonban, hogy a fent említett három további határ-élettérből is tiszta állapotban sikerült izolálnunk az M 102 jelű, metánt oxidáló baktériumtörzset. 20 A találmány szerinti eljárás végrehajtása során a fenti határ-élettérből elkülönített talajüledéket első lépésben dúsító tenyésztésnek vetjük alá. A dúsító tenyésztést úgy végezzük, hogy a folyékony ásványi anyag-tápoldatba helyezett talajüledéket szokásos 25 típusú fermentorban kb. 1:1 arányú metán-levegő gázeleggyel kezeljük. Folyékony ásványi anyag-tápoldatként pl. a Kaserer: Zbl. Bakt. II. rész, 15. kötet (1906) szakkönyv 573-576. oldalán leírt tápoldatot használhatjuk, 30 amelyhez literenként 1 ml un. Hoagland A-Z-oldatot adunk. Az utóbbi oldat előállítását pl. az E.G. Pringsheim:, Algenreinkulturen, ihre Herstellung und Erhaltung" c. szakkönyv [Fischer—Verlag, Jena (1954)] 1-109. oldalai ismertetik. Folyékony ásványi 35 anyag-tápoldatként továbbá a Leadbetter és Foster által ismertetett közeget [Arch. f. Mikrobiol. 30, 91-118(1958)] is alkalmazhatjuk. A Kaserer-oldat összetétele a következő: víz 100 ml 40 K2 HP0 4 0,05 g NH,C1 0,10 g MgS04 -7H 2 0 0,02 g FeCl3 nyomokban A Hoagland A-Z oldat összetétele a követkeóok 45 desztillált víz 18 liter LiCl • 0,5 g CuS04 • 5H 2 0 1,0 g ZnS04 • 7H 2 0 1,0 g H3 B0 4 11,0 g 50 A12 (S0 4 ) 3 1,0 g SnCl3 -H 2 0 0,5 g NiS04 • 6H 2 0 1,0 g MnCl2 «4H 2 0 7,0 g Co(N03 )2 -6H 2 0 1,0g 55 Ti02 1,0 g KI 0,5g KBr 0,5 g A Leadbetter-Foster oldat összetétele a következő: NaN03 2,0 g 60MgSO4 -7H 2 O 0,2 g FeS04 • 7H 2 0 1,0 mg Na2 HP0 4 0,21 g NaH2 P0 4 0,09 g Cu (CuS04 • 5 H2 O alakjában) 5 jug 65 B(H3 B0 3 alakjában) 10 jug 2
