168378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein kromotográfiás elkülönítésére egy lépésben

7 168378 8 valamint a kiindulási oldatba így nem kerülnek be más típusú sók vagy szerves anyagok. Az oldhatatlan sejt-alkotórészek — melyek az ép sejt mintegy 2 súly%-át képezik - eltávolítása után az elroncsolt vörös vérsejtek oldható fehérjeinek oldatát úgy érintkeztetjük valamilyen kromatográfiában használt adszorbenssel, hogy azon az orgotein adszorbeálódjon. Ha az elkülönített extraktum vagy a hígított vörösvérsejt-elegy ionerőssége nagyobb, mint mintegy 0,01 mól, szükségessé válik ionerősségük csökkentése, hogy biztosítható legyen az orgotein specifikus adszorpciója az ioncserélő gyantán. Az ionerősség csökkentését legkedvezőbben hígítás vagy dialízis útján érjük el, az utóbbi esetben vízzel vagy előnyösen kis ionerősségű pufferrel, különösen előnyösen kromatográfiás elkülönítés során használt pufferrel, azaz foszfáttal szemben végzett dialízis útján. Minthogy az oldott sók nagy mértékben befolyásolják az orgotein adszorbeálhatóságát a kromatográfiás adszorbensen, a kromatográfiai műveleti lépéshez használt oldható fehérjeoldat kis ionerősségű kell hogy legyen, (kisebb mint mintegy 0,01 mólos), vagyis 0,001-0,005 mólos oldat előnyös. Ha az oldat ionerőssége nagyobb, az esetben az ionerősség könnyen csökkenthető hígítás vagy egyszerű, vízzel vagy mintegy 1-5 X 10~3 mól ionerősségű pufferrel, előnyösen a kromatográfiás elkülönítés során használt pufferrel, azaz foszfáttal szemben végzett membrán-dialízis útján. A kiindulási oldat ionerősségét biztosító só pontos jellege nem kritikus paraméter. A foszfát-sók előnyösek, minthogy a kívánt, mintegy 6 körüli pH-érték ezekkel a pufferekkel könnyen fenntartható a kívánt alacsony ionerősség mellett. A találmány szerinti eljárás foganatosítására előnyös pH mintegy 6, azaz 5,7—6,3, beleértve a kromatográfiás adszorbensen történő orgoteinadszorpciós lépést is. Azonban a szelektív eluálási lépés jobban függ a pH-értékétől, mint az adszorpciós műveleti lépés. Ezért — bár ez nem előnyös — az oldható fehérjék kiindulási oldatának a pH-értéke lehet valamivel kissebb és nagyobb is, azaz pH 4 és pH 8 között mozoghat. Ilyen esetekben a kromatográfiás adszorbenst a minta felvitele előtt ki kell egyensúlyozni majd a mintegy pH 6 értékű eluálási pH-értéket be kell állítani, mielőtt hozzákezdenénk az orgotein szelektív eluálásához. A találmány szerinti eljárás foganatosítására használt kromatográfiai adszorbens enyhén bázikus csoportokat tartalmazó ioncserélő gyanta, mely savas ionok (anionok) megkötésére hajlamos. Ilyen típusú ioncserélő gyanták az ismert cellulóz-és poliszacharidbázisú ioncserélő gyanták, így többek között a (rövidszénláncú)-alkilamino-(rövidszénláncú)-alkil-cellulózok, azaz például a dietil-aminoetil-cellulóz (DEAE), a trietil-arnino-etil-cellulóz (TEAE), a dietil-amino-etil-Sephadex és az úgynevezett QAE-Sephadex (kvaterner amino-etilezett térhálósított dextrán-gyanta), ahol az utóbbiak a Pharmacia svéd cég termékei. Az említett gyanták adszorpciós kapacitása általában mintegy 1,0-5 milliekvivalens/g. Például a DEAE-cellulóz kapacitása 1,0 milliekvivalens/g (száraz súly); a DEAE-Sephadex kapacitása 3,5±0,5 milliekvivalens/g; és a TEAE-Sephadex kapacitása 0,55-0,75 milliekvivalens/g lehet. Az említett gyanták közül előnyösek a DEAE-cellulóz, a TEAE-cellulóz, és a térhálósított, dietil-amino-etil-csoportokat tartalmazó dextrán-gyanták, kü-5 lönösen a DEAE-cellulózok előnyösek. A rostos DEAE-cellulózok előnyösek az átfolyási sebesség következtében, minthogy az nagyobb, mint a kisméretű granulátum esetén. Azonban az utóbbi cellulózváltozat felbontóképessége valamivel nagyobb. 10 Az orgotein elkülönítése az ioncserélő gyanta szelektív eluálása útján történik. A találmány szerinti eljárás értelmében az orgoteint más fehérjékkel alkotott elegyéből ioncserélő gyantából készült oszlopon adszorbeáljuk; a hemoglobint és a többi nem adszor-15 beálódott fehérjét az oszlopból kimossuk; majd az orgoteint az oszlopból szelektíven euláljuk; és a lényegében tiszta orgoteint tartalmazó eluátum-frakciókból az orgoteint elkülönítjük. Bár ezek a műveleti lépések rendszerint kapcsolódnak a gyantához mint a 20 kromatográfiás oszlop alapjához, szakember számára nyilvánvaló, hogy az említett lépésekkel egyenértékű változatok is alkalmazhatók, így például a gyanta szuszpendálható az oldható fehérjék kiindulási oldatával. 25 A használt ioncserélő gyanta mennyisége - bár nem kritikus — hat az elkülönített orgotein termelési hányadára és tisztaságára. Előnyösen mintegy 0,25—0,5 ml gyantát használunk az ép vörös vérsejtek egy milliliterjének vagy 30 mitegy 100 mg extrahált fehérjének a kezelésére, azzal számolva, hogy a kiindulási szövet mintegy 15% oldható fehérjét tartalmaz. A gyantának a fehérjéhez viszonyított nagyobb aránya (térfogat/súly) semmiféle előnnyel nem jár. 35 Minthogy a hemoglobin és a mioglobin az oldható fehérjék kiindulási oldatából az ioncserélő gyantán nem adszorbeálódnak alacsony izoelektromos pontjuk következtében, eltávolításuk az oszlopból más nem adszorbeálódott fehérjékkel együtt meglehetősen 40 egyszerű vizes eluálószerrel, előnyösen olyan eluálószerrel végzett mosás útján, melynek a pH-értéke mintegy 6. Az orgotein eluálásának megelőzésére a használt vizes közeg ionerőssége kisebb kell hogy legyen, mint mintegy 0,01 mól. Ezen műveleti lépés 45 során vizet vagy előnyösen a fentiekben ismertetett puffert, különösen előnyösen foszfát-puffert használunk. Gyakran az oszlop üres térfogatának többszöröse szükséges az oszlopból a hemoglobin és más, nem adszorbeálódott fehérjék eltávolítására. A 50 hemoglobin távozása könnyen észlelhető, minthogy az oszlopot elhagyó folyadék hatására elszíneződik. Amennyiben a hemoglobint és a többi, nem adszorbeálódott fehérjét az oszlopból tökéletesen eltávolítottuk, a következő lépés az orgotein elkülöní-55 tése a többi adszorbeálódott fehérjétől oly módon, hogy lényegében tiszta orgoteint tartalmazó eluátumot kapjunk. Ez végezhető az orgoteinnek az oszlopból végzett szelektív eluálása útján mintegy pH 6, azaz 5,7—6,3 értékű pH-ra beállított vizes eluálószert 60 használva és az ionerősséget úgy változtatva, hogy az adszorbeálódott fehérjék egymás után eluálódjanak. Lényegében tiszta orgotein egy lépésben végezhető, kromatográfiás elkülönítésére vonatkozó találmányunk döntő jellemzője, hogy az adszorbeálódott 65 fehérjék eluálása egymás után menjen végbe, azaz