168350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás AV290 antibiotikomok elkülönítésére

168350 3 4 megfelelő antibiotikum-alkilszulfát komplexek elegyéhez jutunk. A találmány szerinti eljárással a fermentációs zagy vagy a szűrt fermentlé antibiotikum-tartalmát csaknem teljes mértékben elkülönítjük. Az így kapott antibiotikum-alkil-szulfát komplexeket a komponensek elkülönítése nélkül közvetlenül felhasználhatjuk állati takarmányok kiegészítő komponenseként, ami gazdaságossági szempontból igen jelentős előny. Az antibiotikum és alkálifém-alkil-szulfát reakciójában képződő terméket reverzibilisen visszalakítható antibiotikum-alkil-szulfát komplexnek nevezzük. E komplex pontos kémiai szerkezetét nem ismerjük, tudjuk azonban azt, hogy a komponensek között kovalens kötés nincs, ugyanakkor a termék nem egyszerű fizikai keverék. Az antibiotikum és az alkálifém-alkilszulfát kölcsönhatásából keletkező komplexekben a komponensek részarányát nem szabályozzák szigorú sztöchiometrikus arányok. A kémiai kötések reverzibilisek, ugyanis az AV290 antibiotikum különféle módszerekkel, például keresztkötéses karboximetil-dextrángél oszlopon adszorbeáltatva, majd vizes savval eluálva felszabadítható a komplexből. A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként a Streptomyces candidus NRRL 3218 törzs vagy mutánsa fermentációjának lezajlása után kapott teljes fermentációs zagyot is felhasználhatjuk, előnyösen azonban szűrt fermentléből indulunk ki, azaz a zagyból a kezelés előtt szűréssel eltávolítjuk a micéliumokat és az egyéb oldhatatlan anyagokat. A szűréshez például diatómaföldet vagy más hasonló szűrési segédanyagokat használhatunk fel. A találmány szerinti kezelés előtt a teljes fermentációs zagyot vagya szűrt fermentlevet minden esetben 1,9 és 2,1 közötti pH-értékre, előnyösen pH = 2,0-re savanyítjuk. A pH-beállításhoz savként például sósavat, kénsavat, trifluorecetsavat és hasonlókat, sőt még jégecetet is alkalmazhatunk. A megfelelő pH-érték beállítása a találmány szerinti eljárás szempontjából döntő jelentőségű, mert az 1,9-nél alacsonyabb pH-értéken leválasztott AV290 antibiotikum még akkor is bomlásnak indul, ha a szűrőlepényt enyhe körülmények között, például 40 C°-on vákuumban szárítjuk. A savanyítás után az elegyhez lassú ütemben, keverés közben, szobahőmérsékleten vizes alkálifém-alkilszulfát oldatot adunk. A vizes oldat adott esetben több alkálifém-alkilszulfát keverékét tartalmazhatja. A találmány szerint a leválasztást előnyösen körülbelül 15—30 C°-on, célszerűen szobahőmérsékleten hajtjuk végre. Az antibiotikum és az alkálifém-alkilszulfát kölcsönhatása révén vízben nem oldódó komplex képződik, ami kiválik a rendszerből. A kivált komplexet, illetve teljes fermentációs zagy kezelése esetén a komplexet és a fermentációs zagy szilárd komponenseit szűréssel vagy centrifugálással elkülönítjük, majd szárítjuk. A szűrést például présszűrőn végezhetjük. A szűrőlepényt például a következőképpen száríthatjuk: (1) a nedves szilárd anyagot vízzel elegyedő, poláris, a szilárd anyagot nem oldó szerves folyadékkal, például acetonnal keverjük össze, az elegyet szűrjük, a szűrőlepényt öblítjük, majd levegőn szárítjuk; vagy (2) a nedves szilárd anyagot vízben újra szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót porlasztva vagy fagyasztva szárítjuk. Az így kapott, az AV290 antibiotikumot nem károsító hőmérsékleti körülmények között gondosan 5 megszárított alkil-szulfát-komplexek rendszerint fehértől cserszínűig változó árnyalatú porok. A fermentációs vagy szilárd anyagaival együtt elkülönített alkil-szulfát-komplexek rendszerint szürkétől barnáig változó árnyalatú porok vagy szilárd anyagok. 10 Szárított állapotban ezek a termékek rendkívül stabilok, és igen hosszú ideig eltarthatok anélkül, hogy a termék antibiotikus aktivitása jelentős mértékben megváltozna. A komplexek e nagy stabilitása és tárolhatósága gyakorlati szempontból rendkívül elő: 15 nyös. A találmány szerinti eljárás további előnyös vonása, hogy az antibiotikum-komplex leválasztásához szükséges alkálifém-alkil-szulfát mennyiség nem döntő jelentőségű, és nincsenek szigorúan követendő 20 sztöchiometriai összefüggések. Ha a leválasztást a teljes fermentációs zagyból végezzük, 1 gramm AV290 antibiotikum elkülönítéséhez általában 1,5-2,5 g, célszerűen 2,0 g alkálifém-alkil-szulfátot használunk fel. A teljes fermentációs zagy AV290 25 antibiotikum-tartalmát a 3 338 786 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett mikrobiológiai vizsgálati módszerrel egyszerűen meghatározhatjuk; a meghatározás előtt a minta pH-ját 8,0 és 9,0 közötti értékre állítjuk be. A meghatározást 30 előnyösen a tetraciklinek mennyiségi mérésére alkalmazott, Staphylococcus aureus felhasználásával végzett turbidimetriás méréshez hasonlóan hajtjuk végre (lásd: „Assay Methods of Antibiotics, a Laboratory Manual", Grove és Randall, Medical Encyclopedia, 35 Inc. 1955, 48-52. oldal). A mérés alapján számított alkálifém-alkil-szulfát mennyiséget ezután előnyösen megfelelő mennyiségű vízben oldjuk vagy szuszpendáljuk, és az így kapott oldatot vagy szuszpenziót adjuk a teljes fermentációs zagyhoz. Az alkálifém-40 alkilszulfát esetlegesen fölöslegben maradó mennyisége oldatban marad, így a csapadék elkülönítésekor nem okoz problémát. Szűrt fermentlé kezelése esetén 1 g AV290 antibiotikum leválasztásához általában körülbelül 1 g 45 alkálifém-alkil-szulfátra van szükség. Az a tény, hogy a teljes fermentációs zagyból történő leválasztás esetén nagyobb mennyiségű alkálifém-alkil-szulfátra van szükség, annak tulajdonítható, hogy a fermentléből az antibiotikum-tartalmú komplexszel együtt 50 más fehérjetartalmú anyagok is leválnak. Az antibiotikum szűrt fermentléből történő teljes mértékű leválasztásához minimálisan szükséges alkálifém-alkilszulfát mennyiséget a következőképpen határozhatjuk meg: A teljes fermentációs zagyból mintát ve-55 szünk (a minta térfogata általában 50—100 ml), és a micéliumot, valamint az egyéb oldhatatlan anyagokat szűréssel eltávolítjuk. A szűréshez előnyösen szűrési segédanyagot használunk fel. Ezután a szűrletet híg vizes ásványi savval, például lúg sósavoldattal, híg 60 kénsavoldattal híg foszforsavoldattal vagy hasonlókkal 1,9 és 2,1 közötti pH-értékre savanyítjuk, és a kapott oldatot a megfelelő alkálifém-alkil-szulfát vizes oldatával titráljuk. A titrálás végpontjának äzt az értéket tekintjük, amikor az oldatból csapadék már 65 nem válik le, illetve az oldat zavarossága már nem 2