168325. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino- 3-metil-cef-3-ém-4- karbonsav enzimes előállítására

4 Kíiíyvera citrophila ATCC 21285, Proteus rettgeri AfCC 9250 vagy Micrococcus sp. NRRL B-2753 törzsek olyan enzimet termelnek, amely képes a 7-fehoxiacet-armdo-3-metili-cef-3-ém-4-karbonsav és a 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-ém4-karbonsav amidkötésének lebontására.Azt találtuk továbbá, hogy ha a 7-fenilacetamido-3-metil-cef- 3-ém4-karbonsavat a fenti törzsekből származó enzimkészítményekkel kezeljük, akkor a 6-ADCA néven ismert vegyületet' kapjuk. A találmány tárgya eljárás gyógyszerkészítményként használható antibiotikus cefaloszporinok intermedierjének enzimes előállítására. A találmány értelmében a II képletű 7-ADCA előállítására egy 7-acilamino-3-metil-cef- 3-ém-4-karbonsav I általános képletű vízben oldható sóját — ebben a képletben R benzil- vagy fenoximetil-csoportot és M alkáiifématomot jelent -[a továbbiakban Ce (I)] az amidkötés felhasítására képes enzimet a termelő Arthrobacter simplex ATCC 15 799 Kluyvera citrophila ATCC 21 285 Proteus rettgeri ATCC 9250 vagy Micrococcus sp. NRRL B-2753 nikroorganizmus törzsek fermentlevének szüredékével, a baktériumsejtekkel vagy az enzimkészítménnyel dezacilezzük. Az enzimet előnyösen olyan hordozón adszorbeáltatjuk, amely az enzimet nem inaktiválja. A 7-ADCA-t a kapott reakcióoldatból elkülöníthetjük. Az adszorbeáló hordozó használatával elkerüljük a fermentléből az enzim költséges elkülönítésének szükségességét. Az enzim a hordozón szilárd állapotban van. így az enzimet ismételten felhasználhatjuk anélkül, hogy inaktiválódna. A 7-acilamino-3-metilcef-3-ém-4-karbonsav vízoldható sójának vizes oldatát az említett hordhozóval töltött oszlopon vezethetjük keresztül, és a 7-ADCA-t rendkívül magas kitermeléssel kapjuk, és ezen felül az enzim a 7-acilamino -3-metil-cef-3-ém-4-karbonsavat folyamatosan dezacilezi, és így magas hatásfokkal alkalmazhatjuk. A találmány szerinti eljárásban használt enzimet az Arthrobacter: simplex ATCC 15799, Kluyvera citrophila ATCC 21285, Proteus rettgeri ATCC 9250 vagy Micrococcus sp. NRRL B-2753 törzsek levegőztetett fermentációjával állíthatjuk elő 28—35 C°-on 18—72 óra alatt a mikroorganizmusok tenyésztésére alkalmas szokásos közegben, például megfelelő mennyiségű nitrogénforrást, mint amilyen a pepton, húskivonat, kukoricalekvár, élesztőkivonat, szárított élesztő, szójabab-protein hidrolizátum, szénfonást, mint amilyen a melasz, szőlőcukor vagy glicerin, és szervetlen sókat és adott esetben egyéb növekedést serkentő anyagokat tartalmazó táptalajon. Áltlában a levegőztetést a fermentlé keverésével végezzük. Az enzim rendesen exo- vagy endoenzim, és a fermentlé szüredékében vagy a mikroorganizmussejtekben van. Az enzimes reakcióban tehát az enzimet a fermentlé szüredéke vagy a fermentlé alakjában alkalmazzuk, vagy a mikroorganizmus sejtekből vagy a szűrt fermentléből készült enzimkészítmény formájában. Az enzimkészítményt az enzim szokásos módon való kezelésével állítjuk elő. Az ismert módon előállított enzimoldatot csökkentett nyomáson bepároljuk, liofílizáljuk vagy hasonló módszerrel szilárd terméket állítunk elő, vagy közvetlenül is felhasználjuk a Ce(T) kezelésére. Endoenzim esetén enzimkészítményt fermentlét vagy mikroorganizmus-sejteket, a mikroorganizmus-sejtek szuszpenzióját, liofilizált sejteket, acetonnal szárított sejteket vagy hasonlókat használhatunk a reakcióhoz. Az enzimes reakciót a Ce(I) vízben vagy puffer» 5 oldatban való oldásával, majd az oldatnak a fenti enzimkészítményekkel való kezelésével végezhetjük. A Ce(I>t átalakíthatjuk vízoldható kálium- vagy nátriumsójává, és 0,1-2,0 s/tf%, előnyösen 0,5-ls/tf% koncentrációban alkalmazzuk. A reakcióoldat pH-10 értékét előnyösen 7—8-ra állítjuk be. A reakcióhőmérséklet 20-45 °C előnyösen 30-37 °C amikor is kiváló eredményeket kaphatunk. A reakciókörülmények határozzák meg a reakcióidőt, ez általában 3—30 óra, és a reakciót akkor fejezzük be, amikor a II 15 képletű 7-ADCA kitermelése maximális. A találmány szerinti eljárásban használt hordozónak olyannak kell lennie, hogy a dezacilező enzimet inaktiválása nélkül adszorbeálja, vízzel az enzim ne legyen lemosható, a Ce(I)-dezacilezési reakciót alap-20 vetően ne befolyásolja, és a kapott 7-ADCA-t jelentősen ne adszorbeálja. Például ha szervetlen hordozót, mint amilyen a kovaföld, vagy ioncserélőt, mint amilyen a karboximetilcellulóz vagy egy ioncserélő műgyantát, mint amilyen az Amberlite CG-50, hasz-25 nálunk, akkor a mikroorganizmusok által termelt Ce(I)-dezacilező enzim ezeken jól adszorbeálódik anélkül, hogy hatástalanná válna. A Ce(I)/dezacilező enzimnek hordozón való adszorbeálásakor előnyös, ha a Ce(I)-dezacilező enzi-30 met termelő törzs fermentlevét előzőleg a dezacilező enzim állandó pH-értékére állítjuk. A dezacilező enzim adszorbeáltatását a hordozón szakaszosan vagy folyamatosan (oszlopon) végezhetjük. A használt hordozó mennyisége az enzim mennyi-35 ségétől és aktivitásától és a dezacilező enzimnek a hordozón való adszorbeálódó képességétől függ. Ha az enzimet adagonként adszorbeáltatjuk, akkor a hordozó mennyisége 5-15 súly/tf% a fermentlé mennyiségére számítva, vagy a mikroorganizmus-40 sejtek mennyiségre számítva 50—20 szoros feleslegben van. A fermentlé szüredéket és a hordozót összekeverjük, majd keverés után a horodozót elválasztjuk, és vízzel mossuk. Ha az adszorpciót oszlopon végezzük, akkor az oszlopban elhelyezett hordozót vízzel vagy 45 dezacilező enzim állandó pH-értékének tartására alkalmas pufferoldattal megnedvesítjük, a fermentlevét vagy az enzimoldatot az oszlopon keresztülbocsátjuk, majd az oszlopot vízzel mossuk. Ha az így kapott szilárd készítményt megszárítjuk, 50 akkor a dezacilező enzim hajlamos aktivitásának elvesztésére. Ezért célszerű, ha a készítményt nedves állapotban tartjuk. A találmány szerinti eljárásban használt Ce(I)-t ismert eljárásokkal például a 166 587 lajstromszámú 55 magyar szabadalmi leírás szerint állíthatjuk elő. Mivel a találmány szerinti Ce(I)-dezacilezési reakciót vizes oldatban hajtjuk végre, azért a Ce(I)-nek vízben - oldható alkálifémsója, például kálium/vagy nátriumsója alakjában kell lennie. 60 A találmány szerinti eljárás egyik előnyös végrehajtási módja szerinti a Ce(I) vizes oldatát hordozón adszorbeált dezacilező enzimmel kezeljük, és célszerű, ha az oldatot a dezacilező enzim pH-értékének optimumára pufferoljuk. Az enzimes reakciót előnyö-65 sen oszlopon végezzük, így a műveletet folyamatosan 2