168325. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino- 3-metil-cef-3-ém-4- karbonsav enzimes előállítására

hajthatjuk végre. A Ce(I) oldat koncentrációja az enzim literétől (azaz a dezacilező enzim Ce(I)-dezacilező képességétől) és az átáramlási sebességtől függ; előnyös, ha a kiáramló reakcióoldatban a nem reagált Ce(I) mennyisége alacsony. Általában a Ce(I) 5 koncentrációja 0,1-2,0 súly/tf%, előnyösen 0,5—1 súly/tf%. A reakciót természetesen alkalmas Ph-értéken és hőmérsékleten végezzük, előnyösen a Ce(I)-dezacilező enzim optimális pH-értékén. A különböző reakció- 10 körülményeket előnyösen úgy választjuk meg, hogy a képződött 7-ADCA kitermelése a lehető legjobb legyen. A reakcióidőt az átáramlási sebesség változtatásával állítjuk be. Általában a reakció befejeződik, mielőtt a vizes Ce(I) oldat keresztülhaladna az oszlop 15 hordozórétegén. Ha az aktivitás kicsi, és nagy mennyiségű Ce(I) maradt a reakcióoldatban, akkor a reakcióoldatot visszatáplálhatjuk. Ha az eljárást folyamatosan végezzük, akkor a vizes Ce(I) oldatot folyamatosan adjuk a hordozóhoz. 20 A Ce(I)-dezacilező hatás azonban napról-napra fokozatosan csökken a különböző baktériumokkal való szennyeződés miatt. Ezt a nehézséget lecsökkenthetjük, ha az oszlop tetejére vagy közvetlenül a hordozóra toluolt öntünk. 25 A találmány szerinti eljárásban egy hordozóréteget több, mint 10 napig használhatunk, így a 7-ADCA-t nagy kitermeléssel és alacsony költséggel állíthatjuk elő. A kapott reakcióoldattól a 7-ADCA-t ismert 30 módon választhatjuk el. A következő példák szemléltetik közelebbről a találmány szerinti eljárást. 1. példa 35 1% peptont, 0,5% élesztőkivonatot és 0,25% nátrium-kloridot tartalmazó 500 ml folyékony táptalajt (pH-értéke 7,3) 5 db 500 ml-es lombikba töltünk, és 20 percig 120 C°-on túlhevített gőzzel sterilizáljuk. A táptalajt beoltjuk az Arthrobacter 40 Simplex ATCC 15 799 törzzsel, és 30 Cc-on

48 óra hosszat rázzuk. Ezután a sejteket összegyűjtve a mikroorganizmus-sejteket 0,9%-os vizes nátriumklorid-oldattal mossuk. A mosott sejteket 500 ml 0,2 mólos foszfátpufferbe (pH-értéke 7,0) szuszpendál- 45 juk, amely 0,1% 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-ém4-karbonsav-nátriumsót tartalmaz, és 37 C°-on 3 óra hosszat inkubáljuk. A 7-ADCA képződési aránya 40%-os. 50 2. példa Az 1. példával azonos módon járunk el, de azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter simplex ATCC 15 799 mikroorganizmus helyett Kluyvera citrophila ATCC 21 285 törzset használunk. A 7-ADCA 55 képződési aránya a reakcióközegből meghatározva 60%. 3. példa A Micrococcus sp. NRRL B-2753 törzset az 1. 60 példában leírt táptalajra helyezzük, és 24 óra hosszat 30°-on rázás közben tenyésztjük. A fermentlevet 7,5 pH-értékre állítjuk, és hozzáadunk 7 - fenilacetamido - 3 - metil - 3 - cef ém -karbonsavat, és az 1. példában leírt körülmények között inkubáljuk. A 7-ADCA képződési aránya 55%-os. 4. példa 1% peptont, 1% húskivonatot és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó 100 ml folyékony táptalajt (pH-értéke 7,0) 500 ml-es lombikba töltünk, és 20 percig 120 C°-on sterilizáljuk. A táptalajt beoltjuk a Proteus rettgeri ATCC 9250 törzzsel, és 30 C°-on 24 óra hosszat rázva tenyésztjük. 2% szőlőcukrot, 1% peptont, 1% húskivonatot és 0,5% nátrium-kloridot tartalmazó 20 liter folyékony táptalajt (pH-értéke 7,0) 30 literes félig nyitott fermentorba töltünk, és 20 percig 120 C°-os túlhevített gőzzel sterilizáljuk. Ezután a fenti mikroorganizmus tenyészetet steril körülmények között a félig nyitott fermentorba töltjük, és 30 C°-on 48 óra hosszat levegőztetés és keverés közben tenyésztjük. A tenyésztés után a tenyészetet 3% szőlőcukrot, 1% kukoricalekvárt, 0,5% élesztőkivonatot, 0,1% dikálium-hidrogén-foszfátot, 0,05% magnézium-szulfátot, és 0,05% nátrium-kloridot tartalmazó 500 folyékony táptalajhoz (pH-értéke 7,0) adjuk egy 1 tonnás tartályban, és levegőzés közben 30 C°-on 72 óra hosszat süllyesztve tenyésztjük. A fermentáció után a fermentlé szüredékhez 4 kg kovaföldet adunk, és 30 percig keverjük, miközben a pH-értékét 7-en tartjuk. Ezután a keveréket centrifugáljuk, és a maradékot vízzel mosva 5,8 kg nedves enzim adszorbeátumot kapunk. Ezt 120X1200 mm-es polivinil-klorid oszlopba helyezzük, és az oszlopon keresztülengedünk 10 mg/ml 7-fenilacetamido-3-metil-3-ém4-karbonsavat 0,1 mólos foszfátpufferban (pH-értéke 7,5), miközben a hőmérsékletet 37 C°-on tartjuk (terjes mennyiség 2 kg/400 liter, átfolyási sebesség 5 liter/óra). Az elúciót 82 óra hosszat folytatva végül 420 liter eluátumot kapunk. Az eluáturrihoz 300 ml acetont adunk, és a kapott oldat pH-értékét 6 n sósavval 4-re állítjuk, majd 30 percig keverjük, és ezután éjszakán át ülepedni hagyjuk. A leülepedett csapadékot szűréssel elválasztjuk, acetonnal mossuk, majd szárítjuk. 1255 g 7-ADCA kristályt kapunk (tisztasága 93%) 90%-os kitermeléssel. Szabadalmi igénypont: Eljárás a II képletű 7-amino-3-metil-cef-3-ém4-karbonsav előállítására azzal jellemezve, hogy egy I általános képletű vízben oldható 7-acilamino-3-metilcef-3-ém4-karbonsav-alkálifémsót - ebben a képletben R benzil- vagy fenoximetil-csoportot jelent, és M a vízben oldható só alkálifém-kationját jelenti — vizes közegben Arthrobacter simplex ATCC 15 799, Kluyvera citrophila i ATCC 21 285, Proteus rettgeri ATCC 9250 vagy Micrococcus sp. NRRL B-2753 mikroorganizmus-törzs dezacilező enzimet tartalmazó sejtjeivel vagy adszorbeált sejtjeit tartalmazó hordozóval kezelünk, majd a képződött II képletű 7-amino-3-metil-cef-ém- 4 -karbonsavat a reakciókeverékből ismert módon kinyerjük. 1 lap rajz A kiadásért felelős: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 76-2218 - Dabasi Nyomda, Budapest - Dabas Felelős vezető: Földes György igazgató