168293. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magasabb B12-vitamin tartalmú fermentlé előállítására a baktérium populáció szinkronizálása útján
168293 6 dául a 30 000 jug/liter B12 -vitamin szint eléréséhez 10-25 nap szükséges (1. példa). Mivel ennek elérése után a fermentáció félfolyamatosan ezen a szinten tartósan fenntartható, ez az „időbefektetési veszteség" a félfolyamatosítás után amortizálódik. Gazdaságosabbá teszi ezt az is, hogy a kitermelést eljárásunkkal, egyidejű félfolyamatosítás mellett is, el lehet érni (2. és 3. példa). A találmány értelmében eljárhatunk úgy is, hogy a kiindulási alacsony (például 10 000/ig/liter) Ü! 2-vitamin szintet nem a fenti, lassú biológiai eljárással emeljük például 30 000 >g/liter Bj 2 -vitamin értékre, hanem egy másik fermentlé szeparálásával készült, úgynevezett fermentlé-sűrítményt (tulajdonképpen baktériumsűrítmény) állítunk elő és ezt a mintegy 80-90 000 Atg/liter B12 -vitamint tartalmazó fermentlé-sűrítményt adjuk a kiinduláshoz használt fermentléhez olyan mennyiségben, hogy annak kiindulási B12 -vitamin szintje ezáltal például 20 000 ^g/liter legyen. A továbbiakban a fermentációt a fentiekben ismertetett szinkronizációs eljárással végezzük. Ez az úgynevezett dúsított szinkron eljárás, amely kezdettől fogva félfolyamatosítható, mint azt a 3. példában leírjuk. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy az eljárásunkban a betáplált anyagok közül a metanolnak, illetve a metanol mennyiségének van kiemelkedő jelentősége. A beadott metanol mennyisége és a belőle keletkezett biogáz mennyisége között egyértelmű és lineáris összefüggés van. Az időegység alatt keletkezett biogáz térfogatát az idő függvényében ábrázolva a gáztermelés sebességgörbéjét kapjuk. A görbe három szakaszból áll: egy meredek felszálló, egy vízszintes (plató) és egy meredek leszálló ágból. A görbe által bezárt terület grafikus integrálja a betáplált metanolból keletkezett gáz összmennyiségét adja. [Simonovits, E., Szontagh T.: XI. Biokémiai Vándorgyűlés (Sopron 1970), 59. és 60. sz. előadás, Szontagh T., Simonovits E., Békés I. né: XI. Biokémiai Vándorgyűlés (Pécs, 1971) 219-225. oldal, Szontagh T., Simonovits E., Békés I.- né, Ezer E., Laukó A.: Xni. Biokémiai Vándorgyűlés (Szombathely, 1972.) 35. számú előadás.] A platomagasság (ml termelt gáz/5 liter fermentlé x óra dimenzióban megadva) jól jellemzi az adott fermentlé aktuális biokémiai aktivitását, ezért ezt az adatot használtuk fel annak megállapítására, hogy adott időpontban a populáció milyen metanolmennyiséget képes 24 órán belül elfogyasztani. Ennek a számértéknek figyelembevétele a fermentáció folytatásánál igen fontos, mert a 24 órán belül el nem fogyasztott metanol mennyiség erősebb felszaporodása a fermentiere toxikus hatást fejt ki. Az alábbi táblázatban foglaltuk azokat a minimális platómagassági értékeket, amelyeknél vagy amelyek felett az adott metanolmennyiséget be lehet táplálni. Platómagasság Betáplált metanol tf% ml/5 1 fermentlé x óra /fermentlé 560 0,5 700 0,6 820 0,7 930 0,8 1050 0,9 1160 1,0 1280 1,1 1400 1,2 1520 1,3 1630 1,4 1740 és felette 1,5 A táblázat szerint, ha például egy 5 1 fermentlevet tartalmazó fermentor platómagasság értéke 20 1100 ml/5 1 fermentlé x óra, abban az esetben a fermentlé térfogatára számított 0,9 tf%, azaz 45 ml metanolt adagolunk be. A találmány szerinti eljárásnál az eddig alkal-25 mázott és a 153 740 lajstromszámú szabadalmi leírásban ismertetett BJ2 -vitamin meghatározási módszer erősen szóró eredményt adott, ezért új elemzési módszert dolgoztunk ki, amelyet az alábbiakban ismertetünk: 125 ml fermentléhez 125 ml desztillált vizet, 23 ml 10%-os ferriklorid és 1,5 ml 10%-os nátriumcianid vizes oldatát adjuk, majd az elegy pH-ér-35 tekét 40%-os nátriumhidroxid vizes oldatával pH 5,2-5,4 értékre állítjuk be. Ezután a rendszert 20 percig autoklávban 121 C°-on tartjuk, majd a feltárt mintát szögcentrifugában ülepítjük. A kapott szupernatanst leöntjük és az így kapott vizes 40 oldatból a BI2 -vitamin értékét oldószeres kirázás és papírkromatográfiás szétválasztás után 580 mm hullámhosszon SPEKOL típusú spektrofotométerrel extinkció mérés alapján határozzuk meg. 45 Mivel a centrifugált üledékben meghatározásaink szerint még körülbelül 10-20%, a szupernatanssal egyenértékű folyadék (tehát ennek megfelelő mennyiségű feltárt B12 -vitamin is van), van, az 50 üledéket 125 ml vízben szuszpendáljuk, újra centrifugáljuk, s a kapott szupernatans BJ2-vitamin értékét a fentihez hozzáadjuk. Magas, 30-40 000 /ug/liter értékű fermentleveknél ez a mennyiség 2000-5000 jug Bi2-vitamin/liter is lehet. 55 Míg a 10 000/ig/liter B12 -vitamint tartalmazó fermentleveknél az egyszerű „100°-os meleg feltárás" megfelelő értéket ad, addig a magas értékűeknél, úgy látszik, a Bj2 -vitamint (a koenzimet) 60 csak magasabb hőfokon végzett hidrolízissel lehet a feltételezett fehérjekötésből leválasztani. Mivel valamely feldolgozási eljárás hatásosságát a fermentlében mért B12 -vitamin mennyiségéhez viszonyítva állapítják meg, fontos az ott levő B12 -vitamin 65 mennyiségét lehetőleg pontosan ismerni. 3
