168293. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magasabb B12-vitamin tartalmú fermentlé előállítására a baktérium populáció szinkronizálása útján
7 168293 8 A találmány tehát eljárás magasabb B12 -vitamin tartalmú fermentlé előállítására metántermelő vegyes baktérium populációval, anaerob, szeptikus körülmények között ismert tápanyagkomponensek és prekurzorok jelenlétében végzett fermentáció útján, azzal jellemezve, hogy a kiindulásként használt B12 -vitamint tartalmazó fermentációs közeghez néhány, célszerűen 3 napig előnyösen 0,5 tf% metanolt, majd ezt követően periodikusan 6-12, előnyösen 10 naponként mintegy 10% fermentlé kivétele után az ismert napi táptalajnak megfelelő minőségi összetételű tápanyag komponenseket, előnyösen kukoricalekvárt, élesztőhidrolizátumot, melaszt, szulfitszennylúgot ammóniumhidroxidot és ammóniumsókat, valamint prekurzorokat, előnyösen 5,6-dimetilbenzimidazolt és kobaltkloridot tartalmazó, de tízszeres töménységű táptalajt adagolunk, ezután 0-2 napig, előnyösen 1 napig, a fermentlé elvétel szüneteltetése mellett 0,4-1,5 tf% mennyiségben csak metanolt adagolunk, majd naponként mintegy 10 tf% fermentlé elvétele után a fenti ismert napi táptalajnak megfelelő minőségi összetételű, egyszeres tápanyag mennyiségű táptalaj adagot adunk az 500-3000 ml/5 1 fermentlé x óra biogáz termelési sebességtartományban 0,4—l,5tf% metanol beadagolása mellett, majd ezt a periodikus műveletsort a fermentlé pH-értékének 5,6-6,0-ra történő csökkenésekor a fermentáció egész további menete során ismételjük. A találmány szerinti eljárás előnyei a következőkben foglalhatók össze: 1. Olyan magas B12 -vitamin értéket képes bizonyos körülmények között laboratóriumi méretekben termelni, amelyet eddig szeptikus fermentációkkal elérni nem sikerült, és amely eddig még mesterségesen aktivált monokultúrás fermentációkban is alig fordult elő. A fenti magas, a jelenlegi üzemi átlagos 10 000 Mg/liter B12 -vitaminnál mintegy 3,5-4-szer magasabb laboratóriumi Bi2 -vitamin értéket szinkronizált periódusos eljárásunkkal (a jelenleg az üzemben használthoz képest) 2-2,5-szeres tápanyag-, és 3-szoros metanol mennyiséggel kapjuk. 2. A laboratóriumban kidolgozott, s ott sokszor reprodukált eljárással 50 köbméteres vasfermentorban is sikerült a fermentlevekben félfolyamatosan mintegy 1 hónapon át a B12-vitamin szintet 30-35 000 Mg/liter értéken tartani (4. példa). A szinkronizálási technikát eddig csak tudományos célokra: például a baktériumok duplikálódási idejének meghatározására használták fel. A találmány szerinti eljárással ezt egyrészt először használtuk fel fermentációs eljárásban, másrészt először alkalmaztuk több fajta baktériumból álló szeptikus tenyészetben. Ismeretes, hogy minden baktériumnak más, és más — többé-kevésbé jellemző — a duplikálódási ideje, s így vegyes tenyészet egy eljárással tulajdonképpen nem szinkronizálható. Eljárásunkban az éheztetést használtuk fel a szinkronizálásra, és ezzel hoztuk a különböző baktériumokat nagyjából egységes — nyugalmi (inaktív) — szakaszba. Az ilyen módon szinkronizált különféle baktériumoknak, kísérletileg megállapított időközökben és mennyiségben, periódusosán adott tápanyag- és energia-forrással, értük el a B12 -vitamin termelés szempontjából optimális ered-5 ményt: a fajlagosan legjobban termelő coccus-diplococcus erősebb elszaporodását a rosszabbul termelő példák fölött. A találmány szerinti eljárást az alábbi példák szemléltetik: 1. példa Két 5 liter hasznos térfogatú, gázelvezető csonk-15 kai ellátott kísérleti fermentorba 5—5 liter és 159 356 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint termelt üzemi fermentlevet töltünk, amelynek B12 -vitamin tartalma 9 936 jug/liter. A fermentorokat 32—34°-os termosztátba helyezzük. A kí-20 sérlet első három napján fermentlé elvétel szünetel és csak 25-25 ml metanolt adagolunk be. A 4. napon 500 ml fermentlé levétele után az alábbi összetételű táptalajt [a továbbiakban (Ti0 )]. adjuk be: 25 kukoricalekvár 24,0 g sörélesztő-hidrolizátum 20%-os 5,0 ml boro styánkősavanhidrid 0,03 g kobaltklorid 0,05 g 5,6-dimetil-benzimidazol 0,015 g magnéziumklorid 0,5 g melasz 10 g szulfitszennylúg 8g májextraktum, 10%-os 5ml glicin 0,03 g ammóniumhidroxid 24%-os 5,5 ml diammónium-hidrogénfoszfát 10 g ammónium-hidrogénkarbonát 15 g ammóniumszul fát 7,5 g nátriumbiszulfit 0,1g csapvíz ad 500,0 ml A következőkben táblázatos formában közöljük a két fermentor adatait. A Tj táptalajmennyiség a 45 fentebb leírt T10 egytized részének felel meg. A továbbiakban a fermentorokba a 10., 17., 25., 33., 40., 46., 52., 60., 66. és 72. napon a fenti (Tio) tápanyagmennyiséget adjuk be 10% 50 fermentlé elvétele mellett (mert a pH-érték ezeken a napokon 5,5-6,0-ra süllyedt). Az 5., 6., 7., 8., 9., 11., 12., 13., 14., 15., 16., 18., 19., 20., 21., 22., 23., 24., (mert ez a felviteli szakasz), 26., 34., 4L, 47., 53., 61., 67., 73. és 74. (mert ezek a 55 T10 táptalaj beadagolást követő napok) napon a \ fermentlé elvétel szünetel és csak metanolt táplálunk be. A kísérlet többi napjain a fenti tápanyagmennyiségek egy tizedét (T^ tápláljuk be 10% fermentlé elvétele mellett. A metanol maxi-60 malis mennyisége 75 ml (1,5 tf%), ennek beadagolását a leíró részben közölt táblázat szerint végezzük. Az alábbi táblázatban foglaltuk össze az A és B fermentorban a példa szerint végzett fermentáció 65 adatait: 4
