168293. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magasabb B12-vitamin tartalmú fermentlé előállítására a baktérium populáció szinkronizálása útján
3 168293 4 szaporodására jellemző, valódi .Jogaritmikus fázis", ezeknél a baktériumoknál nincs. Szaporodásuk típusa inkább a Lamana-Mallette [0. Lamana, M. Mallette: Basic Bacteriology 368, (1965)] által leírt számtani haladványnak felel meg. Ismeretes az is, hogy a baktériumok — megfelelő körülmények esetén — kettéhasadás útján szaporodnak, azaz egy baktériumból kettő lesz. Kedvező külső körülmények esetén a már oszlásban levő baktériumok duplikálódása tovább folytatódik, ellenkező esetben a baktériumok nyugalmi állapotba kerülnek. Ebből, — az ökológiai viszonyok megfelelő alakulása esetén — csak hosszabb vagy rövidebb felkészülés - lag fázis - után indulnak újabb oszlásnak. Ez a baktériumok szaporodási ciklusa. Egy adott tenyészetben a baktériumok a szaporodási ciklus igen különböző fázisaiban vannak. 3. Ha egy félfolyamatosan végzett fermentációnk (napi 10% fermentlé kivétel és ugyanannyi táptalajjal pótlás) során a fermentlé baktérium és Bi 2 -vitamin tartalmát naponta meghatározzuk, úgy ezeket az értékeket nagyjából azonosaknak találjuk, azaz a baktériumok száma és a B12 -vitamin mennyisége is — 24 óra alatt, a megelőző kivétel előtti szintre visszaáll. Ezt a tényt sematikusan így érzékeltethetjük: a fermentleben például 100 (millió vagy milliárd) baktérium van, és ebből 10%-ot kiveszünk, majd helyette ugyanolyan térfogatú új táptalajt adunk, úgy az új táptalajjal felhígított fermentleben már csak 90 baktérium marad. Ez a szám azonban másnapra ismét 100-ra szaporodik fel. Esetünkben ez a legegyszerűbben úgy magyarázható, hogy a visszamaradt 90 baktériumból csak 10 oszlott ketté, azaz 10-ből 20 lett, ami a nem oszlott 80-al együtt adja ismét ugyanazt a baktériumszámot, a 100-at. Magasabb baktériumszám- és így nagyobb Bi 2 -vitaminhozam - elérésére tehát azt tűztük ki, hogy egyszerre ne csak például 10, hanem minél több baktérium osztódjék, és így a fermentleben levő baktériumok száma az aktuális szint fölé emelkedjék. Ezt azáltal kívántuk elérni, hogy a baktériumok minél nagyobb számát a szaporodási ciklus azonos fázisába hozzuk, tehát szaporodásukat szinkronizáljuk. A találmány lényege (új fermentáció indításakor és a már magas Bi2 -vitamin értékű fermentlé félfolyamatos fenntartásakor ugyanaz): a baktériumtömeg szaporodási állapotának lehető szinkronizálása. A találmány értelmében oly módon járunk el, hogy valamely mintegy 10 000 jug/liter B12 -vitamin tartalmú félfolyamatosan fenntartott fermentléből indulunk ki, a populációt három napig kevés metanol adagolása mellett tartó éheztetéssel olyan állapotba hozzuk, hogy a még oszlásban levő baktériumok oszlása befejeződjék, de új oszlás a tápanyag hiánya miatt ne indulhasson el. A sejtek ily módon a nyugalmi, „stacioner", illetve „lag" fázisban lesznek. A negyedik napon a fermentléhez egyszerre, az anaerob, szeptikus körül-5 menyek között metánt termelő vegyes baktérium-populációval végzett fermentációknál ismert minőségi összetételű (159 356 és 163 342 számú magyar szabadalmi leírások), de tízszeres töménységű tápanyagkomponenseket, — előnyösen kukoricalekvárt, 10 élesztőhidrolizátumot, melaszt, szulfítszennylúgot, ammóniumhidroxidot és ammóniumsókat —, valamint prekurzorokat - előnyösen 5,6-dimetilbenzimidazolt és kobaltkloridot — tartalmazó táptalajt (Tio) adunk. Ennek hatására a sejtek a szinkron 15 nyugalmi állapotból osztódásnak (szaporodásnak) indulnak, a fermentlé baktériumszáma az eddigi szint fölé emelkedik. Mivel azonban a baktériumok a nyugalmi állapot különböző („stacioner" illetve Jag") szakaszaiban vannak, kettéoszlásuk is bi-20 zonyos eltolódással indul, illetve fejeződik be, tehát a populáció bizonyos fokig ismét deszinkronizálódik. Azáltal, hogy a több baktérium metabolizmusának fenntartásához szükséges több tápanyagot (T10 ) csak periodikusan, például 10 25 naponként adjuk, e szakasz vége felé a tápanyagmennyiség elégtelen lesz, tehát relatív éhezés következik be, a baktérium populáció (vagy annak egy része) ismét oszlási inaktivitási (nyugalmi) állapotban szinkronizálódik. Megállapítottuk, hogy 30 a tápanyag elégtelenségét mutató jel, hogy a fermentlé pH értéke 5,5-5,8-ra süllyed. Ekkor adjuk a következő -a fentiekben definiált- T10 táptalajt. Ezt az eljárást folytatjuk, amidőn félfolyamatossá tesszük a fermentációt. Ekkor a 35 naponta kivett 10% fermentlé pótlására vele azonos térfogatú - a fentiekben definiált összetételű - Ti tápanyagot adunk, ez a táptalaj a T10 -el jelzett táptalaj komponenseinek egy tízed részét tartalmazza, — majd periodikusan, átlagban 8—10 na-40 ponként adjuk a nagyobbszámú baktérium szaporodásához szükséges T10 jelzésű tápanyagot. A T10 -es tápanyagmennyiség átlagosan 10 naponkénti periodikus beadagolásával, valamint a közbeeső napokon 10% fermentlé kivétele és T, jelzésű 45 tápanyag beadagolásával megfelelő mennyiségű metanol beadagolása mellett sikerült 30 000-40 000 Mg/liter B12 -vitamin értéket elérni és stabilan fenntartani. A Bj 2-vitamin mellett a találmány szerinti eljárásban a Bi2 -vitaminnal egyenlő biológiai értékű úgynevezett III-as faktor is keletkezik, melynek aránya az eddig ismert eljárásainkhoz hasonló, 55 a keletkezett B,2 -vitamin átlagértékének mintegy 25—30%-a. Ez a mennyiség azonban — éppen a magas Bi2 -vitamin szint miatt— jelen esetben már számottevő. A III-as faktor a Bi2 -vitaminnal együtt nyerhető ki és az állattakarmányozásban 60 együtt értékesíthető is. Szükség esetén, főleg a humán gyógyászatban, kromatográfiás módszerrel a Bj 2 -vitamintól el is választható. Ha 10 000 Mg/liter BJ2 -vitamin tartalmú fél-65 folyamatos fermentációból indulunk ki, úgy pél-2
