168222. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 17a-oxa-D-homo-androszta- 1,4,6-trién-3,17-dion előállítására
168222 roszta-4,6-dién-3,17-dion Pénicillium lilacinum (MNG 112) törzzsel 17a-oxa-D-homo-androszta-4,6--dién-3,17-dionná, míg Fusarium caucasicum (MNG 90) törzzsel 17a-oxa-D-homo-androszta-l,4,6-trién-3,17-dionná alakítható át. Mindkét törzs oxigént épít be a kiindulási anyag Ci3-as és Ci 7 -es szénatomjai közé, tehát egy, a Bayer—Villiger oxidációhoz hasonló mikrobiológiai oxidációval kialakítja a kívánt lakton-szerkezetet a D-gyűrűben. Míg a Pénicillium lilacinum (MNG 112) törzzsel kapott 17a-oxa-D-androszta-4,6-dién-3,17-diont 1,2-helyzetben dehidrogénezni kell, hogy a kívánt 17 a -o x a - D -homo-androszta-1,4,6-trién-3,17-dionhoz jussunk, a Fusarium caucasicum (MNG 90) törzs előnye, hogy az 1,2-dehidrogénezést is elvégzi a fermentáció során. A mikrobiológiai eljárásokhoz felhasznált mikroorganizmusokat burgonyás ferde-agaron célszerű fenntartani. A mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló táptalajok szénforrásként keményítőt, dextrint, szacharózt, glükózt, maltózt, glicerint, szójabablisztet, kukorica-lekvárt és malátakivonatot tartalmazhatnak. Nitrogénforrásul a már említett, nitrogént is tartalmazó anyagokon kívül kazeint, peptont és élesztőkivonatot alkalmazhatunk. A táptalajokat szervetlen sókkal egészíthetjük ki. A mikroorganizmusokat süllyesztett, levegőztetett körülmények között 24-30 C° hőmérsékleten célszerű növeszteni, és ugyanilyen körülményeket választunk az átalakításokhoz is. A fermentációk során a termékek keletkezését a fermentlé etil-acetátos extraktumának vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatával követhetjük nyomon. Különösen fontos a gyors vékonyrétegkromatográfiás ellenőrzés a Pénicillium lilacinummal végzett átalakításkor, ahol a kívánt termék hosszabb fermentáció esetén tovább oxidálódik. Az átalakítások befejezése után a gombák micéliumát leszűrjük, és a termékeket a fermentléből etil-acetátos extrakcióval nyerjük ki. A találmány szerinti eljárás a) változatában 17a-oxa-D-homo-androszta-4,6-dién-3,17-dionból 2,3-diklór-5,6-diciano-l ,4-benzokinonnal végzett 1,2-dehidrogénezéssel állítjuk elő a 17a-oxa-D-homo-androszta-l,4,6-trién-3,17-diont. A dehidrogénezőszerből 1,2-1,5 mólekvivalenst célszerű használni. A reakciót benzolos vagy dioxános közegben forráshőmérsékleten célszerű végrehajtani. A gyógyszerként forgalomban levő 17a-oxa-D-homo-androszta-l,4-dién-3,17-dion előnyös kiindulási anyag a 17a-oxa-D-homo-androszta-l,4,6--trién-3,17-dion előállításához. Ebből a kiindulási anyagból A6 -os kettős kötés két lépésben végzett kialakításával jutunk a kívánt termékhez a találmányi eljárás c) változatában. Először a 17a-oxa-D-homo-androszta-l,4-dién-3,17-dionból N-bróm-szukcinimiddel benzoil-peroxid katalizátor jelenlétében végzett allü-helyzetű brómozással 6a-bróm-17a-oxa-D-homo-androszta-l,4-dién-3,17-diont állítunk elő. A reakciót célszerűen 6: 1 arányú széntetraklorid-kloroform elegyben forráshőmérsékleten végezzük. A 6a-bróm-17a-oxa-D-homo-androszta-l,4-dién-3,17-dionból ezután kollidines vagy lutidines közegben végzett forralással hidrogén-bromidot hasítunk ki, ilyen módon dehidrohalogénezéssel jutunk a 17a-oxa-D-homo-androszta-1,4,6-trién-3,l 7-dionhoz. A találmány szerinti eljárással előállított 5 17a-oxa-D-homo-androszta-l,4,6-trién-3,17-dion jelentős hatást fejt ki 7,12-dimetil-benz(a)antracénnel (DMBA) indukált patkány emlőcarcinomára. 200 mg/kg-os per os dózisban hetenként 3-szor alkalmazva 10 tumoros patkányon a következő 10 eredményt kaptuk. Ha az állat viszonylag kis tumorral rendelkezett, végleges gyógyulást sikerült elérni. Közepes nagyságú és számú tumorok esetén a daganatok növekedését sikerült megállítani, sőt 2-3 hónapig tartó visszafejlődés is elérhető volt. 15 Gyorsan növő és igen nagy tumorok növekedését a kezelés már nem tudta befolyásolni. A 7,12-dimetil-benz(a)antracénnel (DMBA) kiváltott tumor ismert módon igen rezisztens. Hasonló vagy erősebb hatás csak erős hormonális mellékhatásokat 20 eredményező androgénekkel (pl. tesztoszteron) érhető el. A 17a-oxa-D-homo-androszta-l,4,6-trién-3,17-dion vizsgálata során semmiféle mellékhatás kifejlődését nem észleltük. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az 25 alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa 30 Pénicillium lilacinum (MNG 112) egyhetes, burgonyás ferde agáron nőtt tenyészetéből 10 ml steril vízzel szuszpenziót készítünk, melynek l-l ml-ével oltunk 10 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100-100 ml alábbi összetételű táptalajt: 35 pepton 8 g glükóz 18 g malátakivonat (szárazanyag) 8 g 40 kukoricalekvár (szárazanyag) 4 g nátrium-klorid 2 g 1 liter csapvízben. 45 A beoltott lombikokat termosztát-szobában 28 C°-on rázatva inkubáljuk 2 napig, majd a kapott tenyészettel beoltunk 20 db 3 literes Erlenmeyer-lombikban sterilezett 700-700 ml fenti összetételű táptalajt. A beoltott 3 literes Erlenmeyer-lombi-50 kokat 28 C°-on rázatva inkubáljuk 1 napig, majd 350—350 mg 4—4 ml acetonban oldott androszta-4,6-dién-3,17-diont adunk hozzájuk, és az inkubálást azonos körülmények között folytatjuk. A szubsztrátum átalakulását a fermentléből vett 55 minták etil-acetátos extraktumának rétegkromatográfiás analízisével követjük nyomon. A rétegkromatográfiás analízisnél Kieselgel HF254+366 adszorbenst (Merck, Darmstadt) és 80% etil-acetát: 20% heptán összetételű futtatórendszert hasz-60 nálunk. A szubsztrátum és a termékek foltjait a rétegkromatogramon 254nm-nél emittáló ultraibolya lámpa segítségével észleljük. A 6 órás fermentációs időt találtuk a legkedvezőbbnek. Ezután a fermentlét leszűrjük, és a szűrletet 3 x 1/3 65 térfogat etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített 2
