168206. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(5-amino-5-karboxi-valeramido)-3-metil-3-cefém- 4-karbonsav előállítására
17 168206 18 mutatható ki. A papírkromatográfiás vizsgálat szerint csak a dezacetoxi-cefalosporin C-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A fenti elkülönítési és tisztítási eljárás szerint előállított liofilizált termék gyakorlatilag tiszta, arnmóniumsóként létező dezacetoxi-cefalosporin C. 4. példa A dezacetoxi-cefalosporin sójának előállítása C mononátrium-60 liter, a 3. példa szerinti eljárással előállított tenyészlevet Hyflo-Super-cel szűrési segédanyag jelenlétében szűrünk. A szűrletet 9,6x150 cm méretű aktív szénnel (Pittsburgh CAL. 12x40) töltött oszlopon kromatografáljuk. Addig mossuk vízzel az oszlopot, míg az effluens színtelen lesz, amiután 50%-os vizes acetonnal eluáljuk az adszorbeálódott hatóanyagot. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, az aceton eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk az oldatot. A desztillációs maradékot 5,9 x 104 cm méretű, IRA-68, acetát-ciklusú gyantával töltött oszlopon kromatografáljuk. Addig mossuk vízzel az oszlopot, míg az effluens átlátszó és színtelen lesz, amiután 0,1 mólos nátriumacetáttal eluáljuk a hatóanyagot. Egyesítjük az aktív frakciókat, majd 4,3 x 72 cm méretű, Pittsburgh CAL. (12x40) aktív szénnel töltött kromatografáló oszlopon vezetjük át az oldatot. Hatszoros oszloptérfogatnyi mennyiségű vízzel mossuk a szenet, a hatóanyagot ezután 30%-os acetonnal eluáljuk. Egyesítjük az aktív frakciókat, az aceton eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk az oldatot, a desztillációs maradékot fagyasztva szárítjuk. így 20-30 g súlyú terméket kapunk, amelynek nátrium-tartalma az analízis adatai szerint 2,5%. A nyers antibiotikum-keveréket nátriumsóként mikrokristályos cellulózból (Avicel) készült kromatografáló oszlopon vezetjük át, amiután a dezacetoxi-cefalosporin C-mononátriumsót szilikagélen, a 3. példában a dezacetoxi-cefalosporin C ammóniumsójának elkülönítése kapcsán ismertetett eljárást megismételve, különítjük el a sókeverékből. Az így előállított vegyület a 3 124576 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint a cefalosporin C-ből hidrogénezéssel előállított dezacetoxi-cefalosporin C-től kromatográfiás vizsgálattal nem különböztethető meg. Az előállított termék a következő tulajdonságokkal rendelkezik: Elemanalízis C14 Hi 8 N 3 0 6 SNa-ra: számított: C 44,32%, H 4,78%, N 11,08%, S 8,45%, mért: C 44,80%, H 5,34%, N 11,74%, S 7,88%. Vizes oldatban vizsgált ultraibolya abszorpciós spektrum: Xmax = 260 m/i (e :"5800). 66%-os dimetilformamidban végzett potenciometrikus titrálás: 5 Kezdeti pH 5,0 pKa 4,0, 5,8 és 10,6. Az előállított vegyület mágneses magrezonancia spektruma (D2 )0): 5,60 (1H, kettős, J=4,5), 5,14 (1H, kettős, J=4,5), 3,98 (1H, többszörös), 3,65 10 [1H, kettős, J=18), 3,33 (1H, kettős, J=18 Hz), 2,55-2,35 (2H, többszörös), 2,06 (3H, egyszeres) és 2,15-1,55 ő (4H, többszörös). 15 5. példa A dezacetoxi-cefalosporin C szabad sav előállítása 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Az előállított vegyület infravörös abszorpciós spektrumában az 1755 cm-1 hullámhosszon létezik elnyelési maximum, ez a iS-laktámkadjonH-csopoit jelenlétére utaL "65 A 4. példában megadott eljárással előállított dezacetoxi-cefalosporin C-mononátriumsót desztillált vízben oldjuk, majd kis részletekben addig adunk az oldathoz AG 50W-X4 (Bio-Rad Laboratories) szulfonált polisztirol típusú gyantát, míg pH-ja 2,5 lesz. Ezután szűréssel elkülönítjük a gyantát,'és a szűrletet liofilizáljuk, amikor száraz, amorf, szilárd halmazállapotú termékként megkapjuk a dezacetoxi-cefalosporin C szabad savat. 6. példa A dezacetoxi-cefalosporin C előállítása Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 törzzsel A Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 spórás tenyészetének előállítására a következő összetételű ferdeagar táptalajon növesztjük a mikroorganizmust. Dextrin Élesztőkivonat Hidrolizált kazein (N-Z Amin-Type A, Scheffield Chemical Company) Húskivonat Agar (háromszor mosott) Desztillált víz 10,00g 1,00 g 2,00 g 1,00 g 20,00 g 1 liter A táptalaj pH-ját nátriumhMroxiddal 7,0-re állítjuk be. A ferdeagart a Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 spóráival oltjuk, majd 4-6 napon át 30 C° hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészetet. Ezután vizes spóra és sejtszuszpenzió előállítására steril desztillált vizet adunk a tenyészethez és gyengén kapargáljuk a felületét. Egy-egy milliliter ilyen szuszpenzióval 100-100 ml, a következő összetételű vegetatív táptalajt oltunk: Glükóz 15,O0g SrójababHszt 15,00 g Kukoricakivonat (szilárd) 5,00g 9
