168206. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(5-amino-5-karboxi-valeramido)-3-metil-3-cefém- 4-karbonsav előállítására
» 168206 20. Kaícluinkarboaát 2jm Natriurokloïkl 5,00g Deazíiöáít víz 1 liter A táptalaj pH-ját nátmimhidioxiddal 6,7-re ál- 5 'tjük be. 24-48 órán át, 30 C° hőmérsékleten, 5 cm okettávolságú, percenként 108-at mozdirló reciprok ázóasztalon inkubáljuk a vegetatív inokulumot. Ezt a tenyészetet használjuk a továbbiakban a 10 dezacetoxi-cefalosporin C előállítására, a következő módon: 40 liter, saválló acélból készült fermentorba 24 liter, a következő összetételű táptalajt adunk: 15 Antifoam A (Dow Corning Company, habzásgátló) 5,00 g Keményítő 1125,00 g Nadrispl 125,00g 20 Szójababdara 500,00 g Glicerin 187,50 g N-Z Amin A 125,00 g FeS04 • 7H 2 0 2,50 g Hideg csapvíz 24 liter végtérfogatra 2S A táptalaj pH-ja eredetileg 5,9 ezt közelítőleg 20 m 5 n nátriumhidroxid oldattal 6,5-re állítjuk be. 30 percen át 120 C° hőmérsékleten és 1 atű és 1,2 atü közötti nyomáson sterilezzük a táptalajt, 30 lehűtjük, majd 5% térfogatú vegetatív inokulummal oltjuk. A fermentációt 30 C° hőmérsékleten 66 órán át folytatjuk, miközben percenként-egységnyi táptalajtérfogatra számítva 0,35 térfogat levegőt vezetünk 35 át a táptalajon és percenként 420-szor forduló mechanikai keverővel keverjük. A tenyészet pH-ja a fermentáció végén 6,3. (Hatóanyagtart.: 13 mg/l). A fentiekben ismertetett eljárással, három fer- 40 mentációval előállított, körülbelül 75 liter tenyészlevet 5% Hyflo Super-Cel szűrési segédanyag (diatómaföld, Johns-Manviile Products) jelenlétében szűrünk. A szűrletet 9,5x130 cm méretű, 8 liter aktív szénnel (Pittsburgh Cal., 12x40) töltött 45 oszlopon kromatografáljuk percenkénti 60 ml-es sebességgel. 10 liter desztillált vízzel (pH 5,2) mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 50%-os vizes acetonnal eluáljuk). Az antibiotikumot tartalmazó frakciókat egye- 50 sítjük, és az aceton eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk az oldatot. A desztillációs maradékot 9,5x140 cm méretű, Dowex 1-X1 (erősen bázikus anioncserélő gyanta, Dow Chemical Co.) formiát-ciklusban levő gyantával töltött osz- 55 lopon kromatografáljuk. 10 liter ionmentes vízzel mossuk az oszlopot, az antibiotikumokat 0,1 n ammóniumformiát oldattal eluáljuk. Egyesítjük az aktív frakciókat és 9,5 x 100 cm méretű, aktív szénnel (Pittsburgh CAL., 12x40) 60 töltött kromatografáló oszlopon engedjük át az oldatot, percenkénti 60 ml-es sebességgel. Vízzel mossuk a gyantaágyat, a biológiailag aktív anyagokat aceton és víz 1:4 arányú elegyével eluáljuk, percenkénti 60 ml-es sebességgel. Az eluálást addig 65 folytatjuk, míg 15~x 2 liter eluáramot kapunk, amiután aceton és víz 1:1 arányú elegyével folytatjuk az eluálást, 18 x 1 liter frakcióig. Egyesítjük az aktív frakciókat, az aceton eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk az oldatot, majd fagyasztva szárítjuk. 40 g a fenti eljárás többszöri megismétlésével kapott fagyasztva szárított terméket 4 liter metanollal extrahálunk oly módon, hogy 16 órán át mágneses keverővel keverjük a szuszpenziót. A metanolban nem oldódó anyagokat szűréssel eltávolítjuk, a metanolos oldathoz 5 térfogatnyi acetont adva kicsapjuk a metanolban oldódó vegyületeket. A csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk, amikor 20,6 g súlyú terméket kapunk. Ezt a lehető legkevesebb vízben oldjuk és 5,8x120 cm méretű, dextránnal (Sephadex G-25) töltött oszlopon kromatografáljuk 1 ml/perc sebességgel. Az aktív anyagokat desztillált vízzel eluáljuk, a hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. Az így kapott termék 10g-nyi mennyiségét acetonitril és víz 55:45 arányú elegyének 256 ml-ében oldjuk, az oldatot 5,5 x85 cm méretű, acetonitril és víz 7 :3 arányú elegyében elkészített szilikagéllel töltött kromatografáló oszlop tetejére öntjük. Az oldat áthaladási sebessége 3 ml/perc. A minta kromatografálása után acetonitril és víz 7:3 arányú elegyével, 5 ml/perc átfolyási sebességgel eluálunk. A legaktívabb frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson töményítjük és liofilezzük. 50 g, a fentiekben ismertetett eljárás többszöri ismétlésével előállított antibiotikum keveréket 80 ml vízben oldunk, az oldatot mikrokristályos cellulózban (Avicel) adszorbeáltatjuk. Szárítjuk a keveréket, majd 7,4x115 cm méretű, acetonitril, n-propanol és víz 1 : 1 :0,5 térfogatarányú elegyével készített Avicel oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 18 ml/perc átfolyási sebességgel a fentivel azonos oldószerrel eluáljuk. Egy liter térfogatú frakciókat különítünk el, majd a papírkromatográfiás vizsgálat vagy a mikrobiológiai értékmérés szerint dezacetoxi-cefalosporin C-t tartalmazókat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot pedig fagyasztva szárítjuk. Dy módon gyakorlatilag tiszta dezacetoxi-cefalosporin C ammóniumsót kapunk. 12 g fagyasztva szárított terméket a következő eljárással tovább .tisztítunk. Az anyagot 75 ml vízben oldjuk, az oldatot 3,0 x 70 cm méretű, vízzel elkészített Amberlite XAD-4 gyantával töltött oszlopon kromatografáljuk. A hatóanyagot 2,5 ml/perc átfolyási sebességgel vízzel eluáljuk, miközben 20-20 ml-énként több frakciót szedünk. A frakciókat paptokromatográfiával és mikrobiológiai értékméréssel vizsgáljuk. A csak dezacetoxi-cefalosporin C-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk, amikor igen tiszta dezacetoxi-cefalosporin C-t kapunk. Az előállított vegyület tulajdonságai a 4. példában ismertetett eljárással előállított vegyület tulajdonságaival azonosak.
