168206. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(5-amino-5-karboxi-valeramido)-3-metil-3-cefém- 4-karbonsav előállítására

15 148206 16 végezzük. A tenyésztés során a táptalajon percenként 40ml steril levegőt buborékoltatunk át. (Hatóanyagtart. 25 mg/l). A hatóanyag elkülönítésére lényegében az előzőekben megadottak szerint járunk el, erre vonatkozóan lásd a 3. példát. 2. példa A dezacetoxi-cefalosporin C előállítására megismételjük az 1. példában ismertetett eljárást, azzal a különbséggel, hogy főfermentációs táptalajként a következő összetételű táptalajt használjuk: A szeszfőzés után visszamaradt desztillációs maradék oldható részei (Nadrisol) (National Distillers 5,00g Products Co., N. Y.) Szójaliszt (Nutrisoy 2000) 5,00g (Archer Daniels Midland Co., Chicago) Mogyoróliszt 5,00 g Melasz 5,00 g Zabliszt 5,00 g Glicerin 10,00 g Csapvíz 1 liter Antifoam A (Dow Corning gyártmányú habzásgátló) 0,20 g Glükóz 5,00 g Dextrin 700 (A. E. 50,00 g Staley Mfg. Co.) Szójababdara 25,00 g Melasz 3,00 g Káliumdihidrogén -0,25 g foszfát Kalciumkarbonát 2,50 g Hideg csapvíz 25 liter végtérfogatra M) 15 20 25 A tenyésztést nem körkörös irányban mozgó, hanem percenkénti 108 lökcjszámú reciprok rázó- 30 asztalon végezzük. Hatóanyagtart. 24 mg/l. 3. példa A dezacetoxi-cefalosporin C előállítása kísérleti üzemben 40 liter össztérfogatú saválló acél fermentorba 24 liter, a következő összetételű táptalajt öntjük: 35 40 45 50 A táptalaj eredeti pH-ja 6,5, ezt nem változtatjuk. A táptalajt 30 percen át 120 C° hőmérsékleten sterilizáljuk, lehűtjük, majd beoltjuk 5%, a 55 6. példában megadott eljárással előállított vegetatív inokulummal. A fermentációt 30 C° hőmérsékleten, 66 órán át végezzük, miközben percenként egységnyi térfogatú 60 fermentiere számítva 0,35 térfogat steril levegőt buborékoltatunk át a táptalajon és percenként 420-as fordulatszámú mechanikai keverővel keverjük. A tenyésztés végére a táptalaj pH-ja 7,5-re emelkedik. 65 A fentiekben megadott eljárással előállított 60 liternyi tenyészlevet (hatóanyag tart: 12 mg/l), Hyflo Super-cel (diatómaföld, Johns-Manville Products Corporation) szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük. A szűrletet 9,6x150 cm méretű, aktív szénnel (Pittsburgh CAL. 12x40, Pittsburgh Activated Carbon Co.) töltött kromatografáló oszlopon vezetjük át. Addig mossuk az oszlopot, míg az effluens színtelen lesz, amiután 50%-os vizes acetonnal eluáljuk a hatóanyagot. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, az aceton eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot 5,9x104 cm méretű, IRA-68, formiát-ciklusú gyantával (Rohm and Hass Co. gyártmánya, amelyet hangyasavas mosással formiát-ciklusúvá alakítunk) töltött oszlopra vezetjük. Vízzel mossuk az oszlopot, míg az effluens átlátszó és színtelen lesz, amiután 0,1 mólos ammóniumfornüát oldattal mosva eluáljuk a hatóanyagot. Egyesítjük az aktív frakciókat, az oldatot 4,3 x 72 cm méretű, aktív szénnel (Pittsburgh CAL. 12x40) töltött oszlopon kromatografáljuk. Hatszoros oszloptérfogatnyi mennyiségű vízzel mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 30%-os vizes acetonitrillel eluáljuk. Egyesítjük a hatóanyagot tartalmazó frakciókat, az acetonitril eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk az oldatot, a desztillációs maradékot fagyasztva szárítjuk. így 25—30 g szilárd halmazállapotú terméket kapunk. A lehető legkevesebb vízben oldjuk a fagyasztva szárított terméket, az oldatot 7,2 x 60 cm méretű, mikrokristályos cellulózból (Avicel, FMC Corporation) töltött oszlopon kromatografáljuk, a cellulózt az oszlopba való töltés előtt 70%-os vizes acetonitrilben szuszpendáljuk, és az aktív oldat adagolása előtt acetonitrillel mossuk. Az aktív oldat kromatográfiája után oszloptérfogatnyi acetonitrillel mossuk az oszlopot, a hatóanyagot pedig metanollal eluáljuk. Összegyűjtjük a hatóanyagot tartalmazó frakciókat, körülbelül 200 ml térfogatra töményítjük az oldatot, majd 10-szeres térfogatú aceton adagolásával kicsapjuk a terméket. Szűréssel elkülönítjük a csapadékot, acetonnal mossuk és csökkentett nyomáson szárítjuk. így 9-12 g súlyú terméket kapunk. Az előzőekben megadott eljárással előállított termék 20 g-ját a lehető legkisebb térfogatú vízben oldjuk, majd 7,2 x 60 cm méretű, szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk az oldatot. A szilikagélt (Grade 950, Davison Chemical) előzőleg vízzel, majd metanollal mossuk, és az oszlopba töltés előtt 70%-os acetonitrilben szuszpendáljuk. A minta kromatográfiája után oszloptérfogatnyi acetonitrillel mossuk a gélt, a hatóanyagot 70%-os acetonitrillel eluáljuk. Több frakciót különítünk el, és a frakciókból vett kismennyiségű mintákat papírkromatográfiával megvizsgáljuk, hogy milyen antibiotikumot tartalmaznak. Az ismert A 16 884 antibiotikum (7-metoxi-cefalosporin C) a korai eluátumokban van, míg a dezacetoxi-cefalosporin C a késői frakciókban 8