167658. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a metanobaktériumos fermentáció B12-vitamin hozamának növelésére
5 167658 6 esetben a félfolyamatos üzemelés során ez az arány 1:12 lesz, azaz félfolyamatos üzemelésnél a metanolszén arányszáma mindig eggyel magasabb, mint a rátáplálás ideje alatt volt. A táblázatban megadott, összetartozó értékek lehetőséget adnak a 11 000-40 000 jug/1 Bi2 -vitamin koncentráció tartományban tetszés szerinti érték beállítására és fenntartására, ez csak az 1:11—1:15 tartományból kiválasztott táptalajkeverék és a rátáplálási időszak időtartalmának a függvénye. Nyilvánvaló, hogy magas arány, például 1:14 betáplálásával egy közepes, például 20 000 /Lig/1 B12 -vitamin koncentrációt rövid rátáplálási időszak (körülbelül 2 nap) alatt el lehet érni. A találmány szerinti eljárás félfolyamtos foganatosításánál lehetőség van a megadott ammónium- nitrogén metanol-szén arány határain belül, naponta a fermentlé 20%-ának az elvételére is, célszerűen két ízben, 12 óránként. A találmány tárgya eljárás a metanobaktériumos fermentáció B12 -vitamin hozamának növelésére mezofil metán termelő vegyes mikropopulációval, anaerob szeptikus körülmények között, ismert táptalajkomponensek és prekurzorok jelenlétében adott esetben folyamatosan végzett fermentáció útján, azzal jellemezve, hogy a kiinduláshoz használt Bj 2 -vitamint tartalmazó fermentációs közeghez legalább 90% ammónium-nitrogén és legalább 90% metanol-szén 1:10—1:20, előnyösen 1:11-1:15 arányú ismert táptalajkomponenseket tartalmazó tápoldatot adunk, majd az ammónium-nitrogén és metanol-szén arányának megfelelő B12 -vitamin szint elérése után a tápanyagkomponenseket tartalmazó tápoldat legalább 90% ammónium-nitrogén és legalább 90% metanol-szén arányát a metanol-szén javára 1:11— 1:21, előnyösen 1:12—l:16-ra növeljük, kívánt esetben naponta a fermentlé mintegy 10%-át, előnyösen két részletben mintegy 20%-át elvesszük, mimeŰett a fermentléhez azonos térfogatú, a fenti ismert tápanyagkomponenseket tartalmazó tápoldatot adunk. A találmány szerinti eljárás lényeges haladást jelent a technika állásához viszonyítva, mert az eddigi mezofil metántermelő vegyes mikropopulációkkal végzett fermentációkkal az alábbi Bi2 -vitamin értékeket sikerült elérni: magyar szabadalom lajstromszáma B12 -vitamin szerint napi pgß. fermentlé elvétel 151.065 3500 10% 153.760 6200 10% 159.356 11500 10% találmány szerinti eljárás 35-40000 10-20% A táblázatból kitűnik, hogy a találmány szerinti eljárásunkkal, olcsóbb tápanyagokkal, 3,5-4-szeres Bi2 -vitaminhozamot sikerült elérnünk, adott esetben az eddigi napi 10% fermentlé elvétel helyett, napi 2x10% fermentlé elvétellel. Ez a tény azt a lényeges gazdasági előnyt is jelenti, hogy adott fermentor térfogatban, olcsóbb, kevesebb és adott esetben 1,5-szörös tápanyagmennyiséggel 2-szeres mennyiségű Bt 2 -vitamin termelhető. A találmány szerinti eljárás előnyei a következőkben foglalhatók össze: 1. A jelenleg üzemben alkalmazott átlag 10 000 Mg/l B12 -vitamin szintet biztosító fermentációs eljárásnál gazdaságosabban átlag 30-40 000 /ug/1 Bi2 -vi-5 tamin szintet biztosít. Ez magasabb, mint melyet eddig szeptikus fermentációkkal sikerült elérni. 2. A fermentációs idő csökkentésével, a naponta levett mennyiség növelésével (20%), a B12 -vitamin szint növelésen kívül is nő a termelt Bi2 -vitamin 10 mennyisége. 3. A laboratóriumi körülmények között sokszor megismételt eljárást, félüzemi 50 m3 -es és üzemi 180 m3 -es fermentorokban is sikeresen reprodukáltuk. A példákban megadott Bi 2 -vitamin érték meghatá-15 rozása az eddig alkalmazott meghatározástól csak a magasabb baktériumkoncentráció miatt szükséges intenzívebb feltárásban különbözik. Az eddig alkalmazott meghatározásnál 500 ml fermentléhez 30 ml 10%-os yas(III)klorid odlatot, 3 20 ml 10%-os nátriumcianid oldatot adtunk, a pH értékét 4,9-5,2-re állítottuk be, majd az oldatot 8 -ig forraltuk, ezután centrifugáltuk és a kapott szupernatanst ismert módon tisztítva a Bi2-vitamint és Bu faktorokat papírkromatográfiás úton határoztuk meg. 25 Kísérleteink során intenzív feltárási módszert dolgoztunk ki és alkalmaztunk, mely szerint 100 ml fermentléhez 400 ml vizet, 12 ml 10%-os vas(III)klorid oldatot, 1,5 ml 10%-os nátriumcianid oldatot adunk, elkeverjük, a pH értékét 4,9—5,2-re állítjuk 30 be, majd a keveréket 8'-forraljuk, ezután centrifugáljuk. Az üledéket 500 ml vízben szuszpendáljuk, 6 ml 10%-os vas(III)klorid és 0,75 ml 10%-os nátriumcianid oldatot adunk hozzá, elkeverjük és a pH értékét 4,9—5,2-re állítjuk be. A keveréket l'-ig 35 forraljuk, majd centrifugáljuk. Az üledéket 500 ml vízben szuszpendáljuk, majd ugyanúgy járunk el, mint a második feltárásnál. A három feltárás során kapott szupematansokat egyesítjük és a további tisztítási lépéseknél úgy járunk el, mint az addig alkalmazott 40 meghatározási módszernél. A fentiekben ismertetett módszerünkkel határoztuk meg a kiinduláshoz alkalmazott (a 159.356 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerinti) fermentlé B12 -vitamin tartalmát is. 45 A találmány szerinti eljárást az alábbi példák szemléltetik: 50 1. példa 10 l-es kísérleti üvegfermentorba 9400 ml 10 500 jug/1 Bu-vitamin tartalmú, a 159.356 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerinti félfolyamatos eljá-55 rással készített, az Országos Közegészségügyi Intézetnél 76, 77, 78 és 79 szám alatt deponált Corynebacterium sp.-t (jelzése 24A1), Corynebacterium sp.-t (jelzése 62B9), Lactobacillus sp.-t (jelzése 244B/C1) és Propionibacterium sp.-t (jelzése 239A1/6) tartalma-60 zó mezofil metántermelő vegyes mikropopulációjú üzemi fermentlevet töltünk. A fermentléhez 100 ml 28—30 C°-os, az alábbi táptalajkomponenseket tartalmazó csapvizet adunk: ammóniumhidrogénkarbonát 4,5 g 65 ammóniumhidroxid 24%-os 1,5 ml diammóniumhidrogénfoszfát 0,45 g ammóniumszulfát 1,5 g
