167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
21 167655 22 14. lépés: , Z-Lys(BOC)-LyslBOC)-Arg (N02 )-Pro-Val-Lys (BOO -Val-TyrfBu*) -Pro-Asn-Gly-Ala-GMOBut)-AsplOBu^-GMOBuVSer-AlalOBut) 3,0 g (2,95 mmol) H-Asn-Gly-Ala-Glu (OBu^-Asp(OBul> GluíOBu^-Ser-Ala-OBu 1 és 5,46 g (2,95 mmol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC) -Arg(N02)-Arg(N0 2 ) -Pro-Val-Lys(BOC) -Val-TyríBu^-Pro-OH-t [155 254 számú magyar szabadalmi leírás] feloldunk 33 ml dimetilformamidban, az oldatot 0 C°-ra hűtjük, majd hozzáadunk 3,35 g (4,42 mmól) DCC-PFPOH komplexet. [J.Kovács és munkatársai: JAm.Chem.Soc . 89_ 183 (1967)].'A reakcióelegyet 15 percig 0 C°-on, majd hat órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk. Ezután a kivált DCU-t leszűrjük és a szűrletet 450 ml vízmentes éterbe öntjük. A kapott szuszpenziót másnapig hidegen állni hagyjuk, majd leszűrjük. A nyers terméket metanolban oldjuk és etilacetáttal leválasztjuk. 7,18 g (85,1%) védett oktadekapeptid észtert kapunk; R/ = 0,35, [a]D = -26,4° (c=0,42, dimetilformamid). 15. lépés: H-Lys(BOC)-Lys(BOC) -Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC) -Val-TyrJBu*) -Pro-Asn-Gly-Ala-GMOBu1 ) -AsptOBu^-GMOButj-Ser-Ala-OBu* 6,5 g (2,28 mmól) Z-Lys(BOC)-Lys (BOC)-Arg(N02 ) -Arg(N0 2 >Pro-Val-Lys(BOC) Val-Tyr(Bu x ) -Pro-Asn-Gly-Ala-GMObut) -AspíOBu^-GluíOBu1 ) -Ser-Ala-OBu^-t feloldunk 85 ml ecetsavban, és 2,0 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk és az olajos maradékot vízmentes éterrel eldörzsöljük. Szűrés után az oktadekapeptidészter-acetátot 70 ml vízben feloldjuk, az oldatot híg sósavval pH 4-re savanyítjuk, majd az oktadekapeptidészter-trihidrokloridot 30%-os nátriumklorid-oldattal kicsapjuk és szűrjük. A terméket etanol-kloroform elegyben oldjuk, az oldatot szűrjük, bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 5,6 g (89,5%) oktadekapeptidészter-trihidrokloridot kapunk; Rf2 = 0,35, [a] n = -26,1° (c=l, dimetilformamid). 16. lépés: BOC-D-OSer-Tyr- Ser-Met-Glu(OBut ) -His-Phe--Arg-Trp-Gly-Lys (BOC)-Pro-Val-Gly-Lys (BOC)-Lys(BOC) -Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC) -Val-Tyr(But ) -Pro-Asn-Gly-Ala-GMOBu*) -AsplOBu1 ) -GMOBu*)Ser-Ala-OBut 0,525 g (0,264 mmól) BOC-D-OSer-Tyr- Ser-Met-GluíOBu*) -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (BOC>Pro-Val~ Gly-OH.HCl-ot, 0,720 g (0,264 mmól) H-Lys(BOC)Lys(BOC)-Arg-Arg -Pro-Val-Lys(BOC)-yal-Tyr(Buí) -Pro-Asn-Gly-Ala-GluíOBut) -AspíOBu^-GMOBu1 ) -Ser-Ala-OBu^ HCl-ot feloldunk 4,0 ml dimetilformamidban, és hozzáadunk 0,03 ml (0,270 mmól) N-metilmorfolint, majd 0,23 g (0,40 mmól) DCC- PFPOH komplexet. A reakcióelegyet 2 napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet 40 ml éterrel hígítjuk. A kicsapódott terméket leszűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk. 1,10 g (89%) védett aminooxikarbonsawal helyettesített dotriakontapeptid-tríhidrokloridot kapunk; op.: 182-186 C°,Rf3 = 0,27. 7. példa H-D-OSer-Tyr -Ser-Met-Glu-His-Phe -Arg-Trp-Gly! -Lys-Pro -Val-Gly-Lys-Lys-Lys-1_ys-Gly-NH2 0,400 g (0,135 mmól) BOC-D-OSer-Tyr -Ser-Met-5 Glu(OBut ) -His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC) -Pro-Val-Gly-Lys(BOC) -Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys-(BOC) -Gly-NH2 .HCl-ot 3,2 ml trifluorecetsav, 0,4 ml anizol és 0,4 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot 1 óra után 80 ml éterrel hígítjuk és a kivált csapadékot leszűrjük. 10 A nyers nonadekapeptidamid trifluoracetátot 10 ml vízben oldjuk és Whatman CM-52 ioncserélőből készített 3,5x51 cm-es oszlopon 1,5 liter 0,2 mól (pH 6,7) és 1,5 liter 0,6 mól (pH 6,7) ammónium acetát pufferből készített lineáris puffergradienssel kro-15 matografáljuk.A terméket tartalmazó 79—91. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,166 g (42%) aminooxikarbonsawal helyettesített nonadekapeptidamidot kapunk. Ft6 = 0,21; peptid tartalom: 77,5%; metionin-szulfoxia tartalom: 0,9%; Tyr/Trp arány: 20 1,05; aminosav analízis: Lys 5,1(5), His 0,9(1), Arg 1,0(1), Ser 1,1(1), Glu 1(1), Pro 0,9(1), Gly 2,8(3), Val 0,9(1), Met 1,0(1), Tyr 1,0(1), Phe 1,0(1). A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített nonadekapeptidamid-hid-25 rokloridot az alábbi módszerrel készítjük: 1. lépés: H-Lys(BOC) -Lys(BOC)-OCH3 .oxalát 30 11,0 g (17,7 mmól) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC) OCH3 -t [ K. Hoffmann és munkatársai: J.Am.ChemJSoc. 86 4991 (1964)]feloldunk 200 ml metanolban, 2,0 g (22,2 mmól) vízmentes oxálsavat adunk hozzá és 2,0 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 9,1 g (89%) dipeptidészter-oxalátot kapunk; op.: 65—67 C (izopropanol-diizopropiléterből átkristályosítva), Rf = 0,34; [a]D = 40 +3,79 (c=l, metanol). 2. lépés: Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3 45 8,1 g (14,0 mmól) H-Lys(BOC) -Lys(BOC)-OCH 3 .oxalátot szuszpendálunk 60 ml etilacetátban, 3,1 ml (28,0 mmól) N-metilmorfolint és 6,7 g (14,0 mmól) Z-Lys(BOC)-ONSu-t adunk hozzá és két órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a besűrűsö-5Q dött reakcióelegyet 200 ml etilacetáttal és 40 ml vízzel hígítjuk. A vizes fázis leválasztása után az etilacetátos oldatot kétszer 40 ml n sósawal, kétszer 40 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk, nátriumszulfáton szárítjuk és bepároljuk. A 55 maradékot diizopropiléterrel eldörzsöljük, majd a nyers terméket izopropanol-diizopropiléter elegyéből átkristályosítjuk. 8,0 g (67%) védett tripeptid-metilésztert kapunk; op.: 117-118 C°, R/ = 0,58, [a]D = -17,47° (c=l, metanol). 60 3. lépés: Z-Lys(BOC) -Lys(BOC)-Lys(BOC) -Lys(BOC) -OCH3 51 g (60 mmól) Z-Lys(BOC>Lys(BOC) -Lys(BOC> 65 -OCH3 -t 100 ml metanolban oldunk és 10 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort 11
