167655. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-terminálisán alfa-aminooxikarbonsavat tartalmazó, új, ACTH hatású polipeptidek előállítására
23 167655 24 kiszűrjük, és az oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot 240 ml etilacetátban oldjuk, 28,5 g (60 mmól) Z-Lys(BOC)-OSu-t adunk hozzá és szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Két óra után a reakcióelegyhez 1000 ml etüacetátot és 200 ml vizet adunk, összerázás után a vizes részt elválasztjuk, az etilacetátos oldatot kétszer 200- ml n sósavval, kétszer 200 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk, majd szárítás után bepároljuk. A maradékot éterrel eldörzsöljük, szűrjük, éterrel mossuk. A nyers terméket etilacetátból átkristályosítjuk. 52,05 g (81%) Z-Lys(BOC>Lys(BOC) -Lys(BOC>Lys(BOC> -OCH3 -t kapunk. Op.: 122-123 C°. 4. lépés: Z-Lys(BOC)-Lys(BOC) -Lys(BOC)-Lys(BOO-N2 H 3 17 g (15,8 mmó) Z-Lys(BOC>Lys(BOC) -Lys(BOC)-Lys(BOC>OCH3 -t 170 ml metanolban oldunk 6,32 ml (126 mmól) hidrazinhidrátot adunk hozzá és szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Három nap múlva az oldatot vákuumban bepároljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, szántás után a nyers terméket metanol-éter elegyéből átkristályosítjuk. 14,8 g (87%) Z-Lys(BOC>Lys(BOC) -Lys(BOC>Lys(BOC> -N2 H 3 -ot kapunk. Op.: 181-183 C°. 5. lépés: Z-Lys(BOC)-Lys(BOC) -Lys(BOC)-Lys(BOC)-Gly-NH2 3,24 g (3,0 mmól) Z-Lys(BOC>Lys(BOC) -Lys(BOC)-Lys(BOC)-N2 H 3 -ot feloldunk 15 ml dimetilformamidban. A —20 C°-ra hűtött oldatba keverés közben becsepegtetünk 3 ml (12 mmól) 4 n etilacetátos sósav oldatot, majd 0,43 ml (3,6 mmól) terc-butilnitritet. A reakcióelegyet 5 percig -10 C°-on tartjuk, majd —20 C°-ra hűtiük és hozzáadjuk 0,26 g (3,5 mmól) H-Gly-NH 2[P.S. Yang, M.M. Rising: J.Am. Chem.Soc. 53_3183 (1931)] és 1,54 ml (9 mmól) diizopropiletilamin 10 ml dimetilformamidos oldatát. A reakcióelegyet 2 órán át —5 és 0 C° közötti hőmérsékleten, majd másnapig 0 C°-on tartjuk. Ezután az oldatot bepároljuk, a maradékot vízzel eldörzsöljük, szűrjük, vízzel mossuk. A nyers terméket metanol-víz 1:1 arányú elegyéből átkristályosítjuk. 3,0 g (89%) Z-Lys(BOe>Lys(BOG) -Lys(BOC> -Lys(BOC)-Gly-NH2-t kapunk. Op: 178-182 C°:% 8 = 0,52. 6. lépés: H-Lys(BOC)-Lys(BOC> -iys(BOG)-Lys(BOC)-Gly -NH2 2,5 g (2,23 mmól) Z-Lys(BOC>Lys(BOC) -Lys(BOC>Lys(BOG)-Gly'NH2 -t 50 ml metanolban feloldunk és 0,5 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, az oldatot bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. 2,0 g (90%) H-Lys(BOC>Lys(BOC) -Lys(BOC>Lys(BOC) -Gly-NH2 ^t kapunk. R^ =0,30. 7. lépés: BOC-D-OSer-Tyr-Ser -Met-G li^OBu^-H is-Phe-Arg-Trp -Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC) -Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Gly-NH2 .HCI 12 0,398 g (0,20 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met -GluíOButj-His-Phe-Arg-Trp -Gly-Lys(BOG>Pro-Val -Gly-OH.HCl-ot, 0,197 g (0,20 mmól) H-Lys(BOQLys(BOC) -Lys(BOC)-Lys(BOC) -Gly-NH-j-t és 0,166 g (0,90 mmól) pentafluorfenolt 3 ml dimetilforma-5 midban feloldunk és 0,063 g (0,30 mmól) DCC-t adunk hozzá. A reakcióelegyet 16 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a DCU-t kiszűrjük és a szűrletet éterrel hígítjuk. A kivált terméket szűrjük, éterrel mossuk, vákuumban szárítjuk, 0,542 g (92%) 10 védett nonadekapeptidamid-hidrokloridot kapunk. •1$*ÜJStK 15 8. példa H-D-OSer-TyrSer -Met-G lu-H is-Phe-Arg-Trp-G ly Lys -Pro-Val-G ly-Lys-Lys-Lys -Lys-Lys-NH2 20 0,400 g (0,128 mmól) BOC-D-OSer-Tyr,Ser -Met-GluíOBu^-His-Phe-Arg.Trp -Gly-Lys(BOC>Pró-Vai -Gly-Lys(BÖC)-Lys(BÖC)-Lys(BQC) -Lys(BOC). Lys(BOC)-NH2 . HCl-ot 3,2 ml trifiuorecetsav, 0,4 ml anizol és 0,4 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot 25 1 óra után 80 ml éterrel hígítjuk és a kivált csapadékot leszűrjük. A nyers nonadekapeptidamid triftuoracetátot 10 ml vízben oldjuk és Whatman CM-52 ioncserélőből készített 3,5x48 cm-es oszlopon 1,5 liter 0,2 mól (pH 6,7) és 1,5 liter 30 0,6 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferból készített lineáris puffergradienssel kromatografáljuk. A terméket tartalmazó 93-107. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,162 g (37%) aminooxikarbonsawal helyettesített nonadekapeptidamidot ka-35 punk. R/ = 0,17; peptid tartalom: 68,1%; metioninszulfoxid tartalom: 0,9%; Tyr/Trp arány: 1,03; aminosav analízis: Lys 5,5(6), His 1,0(1), Arg 0,9(1), Ser 0,87(1), Glu 1,18(1), Pro 1,0(1), Gly 2,0(2), Val 1,0(1), Met 0,87(1), Tyr 1,0(1), Phe 1,0(1). 40 A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített nonadekapeptidamid hidrokloridot az áábbi módszerrel készítjük; 1. lépés: 45 Z-Lys(BOC)-NH 2 11,2 g (20 mmól) Z-Lys(BOC>OH.diciklohexilamin sót 200 ml éterrel és 100 ml n kénsawal oldódásig rázunk. Az éteres oldatot 50 ml vízzel 50 nossuk, majd szárítás után bepároljuk. A maradékot 120 ml vízmentes tetrahidrofuránban oldjuk, 2,8 ml (20 mmól) trietilamint adunk hozzá, majd keverés közben -10 és -20 C° közötti hőmérsékleten 2,6 ml (20 mmól) klórszénsavizobutilésztert csepegtetünk a 55 reakcióelegyhez. Ezután 10 percig -10 C -on tartjuk, majd -10 C° alatti hőmérsékleten 7,5 ml (100 mmól) tömény ammóniumhidroxid oldatot csepegtetünk bele. A keverést még 2 órát foLytatjuk, a reakcióelegy hőmérsékletét közben 0 és 5 C° között tartjuk. A 60 tetrahidrofuránt ezután ledesztilláljuk és a maradékot 180 ml etilacetátban feloldjuk. Az oldatot kétszer 40 ml n sósavvá és kétszer 40 ml 8%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal mossuk, szárítás után bepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. Szűrés, szárítás 65 után 5,0 g (66%) Z-Lys(BOC>NH2 -t kapunk. Op.: 140-141 C°. Elemzés aCi9 H 2 9N 3 O s összegképlet alapján:
