167616. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusellenes hatású komplex előállítására
11 167616 12 származék esetében 2, 4 illetőleg 3. A G-szirodezmin metanolos hidrogén-klorid-oldattal való kezelése útján - amint ezt fentebb már szintén említettük — dezacetil-G-szirodezmint kapunk. E vegyület olvadáspontja 195—196,5 °C körül van; magmáneses rezonancia-színképe deuterokloroformos oldatban a következő r-értékeket mutatja: 9,01, 8,98, 8,77, 8,33, 7,38, 7,13, 6,87, 6,80, 6,14, 5,4 - 5,9 és 4,7 - 5,0. A találmány körébe tartozik tehát az A-, B-, C- és G-szirodezmin dezacetil-származékának az előállítása is: ez a találmány értelmében oly módon történik, hogy az A-, B-, C- vagy G-szirodezmint alkoholos oldatban valamely szervetlen savval kezeljük. Oldószerként valamely vízmentes vagy vizes alkoholt, például metanolt vagy vizes metanolt, savként pedig előnyösen hidrogén-kloridot alkalmazunk. Az A-szirodezmin ecetsavanhidriddel, piridinben, egy órai reakcióidővel történő kezelése útján — amint ezt már szintén említettük - a megfelelő R2 helyén acetil-csoportot tartalmazó monoacetátot kapjuk. Ugyanez a helyzet a B- és C-szirodezmin esetében is; az A-, B- és C-szirodezmin-monoacetát az (I) általános képletnek felel meg; ebben az esetben R2 acetilcsoportot képvisel, míg n értéke 2,4 illetőleg 3. Az A-szirodezmin-monoacetát, B-szirodezminmonoacetát és C-szirodezmin-monoacetát előállítása tehát a találmány értelmében oly módon történik, hogy az A-, B- illetőleg C-szirodezmint oldatban ecetsavanhidriddel vagy valamely ecetsav-halogeniddel, például acetil-kloriddal reagáltatjuk; oldószerként előnyösen valamely hidroxilmentes szerves oldószert alkalmazunk és a reakciót 15 perctől 4 óráig terjedő ideig folytatjuk. Előnyösen ecetsavanhidriddel, piridinben, 1 órai reakcióidővel folytatjuk le ezt a reakciót. Az A-szirodezmin trifenil-foszfinnal kloroformban történő reagáltatása útján — amint ezt szintén már említettük — A-szirodezmin-monoszulfidot kapunk. Ez a vegyület is az (I) általános képletnek felel meg, amikoris R acetilcsoportot, R hidrogénatomot képvisel, n= 1. A találmány kiterjed tehát azon (I) általános képletű szirodezmin előállítására is, melyben n = 1; ezt a vegyületet a találmány értelmében oly módon állítjuk elő, hogy az A-szirodezmin valamely szerves oldószerrel készített oldatát trifenil-foszfinnal kezeljük. Oldószerként például toluol, benzol vagy kloroform alkalmazható; az említettek közül elsősorban a kloroform előnyös. A B-szirodezmin és a C-szirodezmin egyaránt könnyen átalakítható A-szirodezminné, piridinben, 0 °C hőmérsékleten tionil-kloriddal való reagáltatás útján. Ezt az átalakítást végezhetjük közvetlenül is a fermentáció útján előállított komplex vírusellenes szerrel; ily módon számottevően megkönnyítjük az A-szirodezmin elkülönítését és kinyerését. Így tehát a találmány körébe tartozik az A-szirodezmin oly módon történő előállítása is, hogy a B-szirodezmint és/vagy C-szirodezmint, vagy pedig a fermentációs lé szűrletéből kinyert komplex vírusellenes szert valamely oldószerként alkalmazott szerves bázisban, a szobahőmérsékletnél alacsonyabb hőmérsékleten tionil-kloriddal reagáltatjuk. Ha az A-szirodezmint piridinben, szobahőmérsékleten kénnel reagáltatjuk, akkor A-, B- és C-szirodezmin elegyét kapjuk reakciótermékként. így a találmány körébe tartozik a B- és C-szirodezmin olyan előállítási eljárása is, amelynek értelmében az A-szirodezmint valamely szerves oldószerrel készített oldatban, valamely szerves bázis jelenlétében kénnel kezeljük. Oldószerként maga a szerves bázis is 5 alkalmazható. Látható a fentiekből, hogy az A-, B- és C-szirodezmin, valamint ezek monoacetátjai, dezacetil-származékai, továbbá a szirodezmin-monoszulfid egymásba könnyen átalakítható vegyületek. Ezért indokolt, 10 hogy a találmány szerinti eljárás termékeit az (I) általános képlettel jellemezzük (ahol R2 jelentése hidrogénatom vagy acetil-csoport és n = 1, 2, 3 vagy 4); előállítottuk továbbá a 6-helyzetben acetil-csoportot nem tartalmazó dezacetil-származékokat is. 15 Mind a fermentációs lé szűrletének extrahálása útján kapott komplex termék, mind pedig az új A-, B-, C-, D-, E-, F- és G-szirodezmin, amelyeket az említett komplex termékből különíthetünk el, továbbá az ugyancsak új J-szirodezmin, az A-szirodezmin és 20 G-szirodezmin dezacetil-származéka, az A-szirodezmin-monoacetát gazdasejtek jelenlétében vírusellenes hatást mutatnak; különösen jó aktivitásuk van mindezeknek a vegyületeknek emberi embrionális tüdősejtek jelenlétében rhino-vírusok ellen, továbbá a Cox-25 sackie A és B, valamint az Echo vírusok ellen. A hatóanyagoknak a rhino-vírus elleni aktivitását lényegileg az alább ismertetett módszerrel mértük: Emberi embrio-tüdősejteket a szokásos módon tenyésztettünk, az ismert Eagle-féle minimális esszen-30 ciális tápközegben, 1% borjú-szérum hozzáadásával. A tenyésztést 76 mm hosszú, 12,7 mm átmérőjű kémcsövekben végeztük, 33 °C hőmérsékleten történő inkubálással. A vizsgálandó hatóanyagot ugyanilyen közegben oldottuk, 200, 50, 12,5, 3,1, 0,8, 0,2, 35 0,05 illetőleg 0,00 mcg/ml koncentrációban; minden koncentrációval három párhuzamos kísérletet végeztünk. Az említett ható anyag-oldatokat hozzáadtuk a fenti sejt-tenyészethez, az inkubálást 33 °C-on tovább folytattuk, majd 24 óra múlva az egyes kémcsövek 40 tartalmát beoltottuk a rhino-vírus (például 2. típusú rhino-vírus-törzs) olyan adagjával, amely a sejt-tenyészetre számított 50%-os fertőző adag 100-szorosának felel meg. Az inkubációt 33 °C hőmérsékleten további két napig folytattuk, majd minden egyes kémcsö-45 vet vizuálisan megvizsgáltunk, a vizsgált hatóanyag által esetleg okozott citopatogén hatás, valamint a vírusok fejlődése által okozott citopatogén hatás megállapítása céljából. A hatóanyag által okozott károsító hatás generálisan mutatkozik az egész sejt-te-50 nyészeten, míg a vírusok által okozott citopatogén hatás jellemző fokális hatásként mutatkozik, amely könnyen megkülönböztethető az előbbitől. A vizsgált hatóanyag aktív adagjának azt a koncentrációt tekintettük, amely 50%-ban védi meg a sejteket a vírus 55 citopatogén hatásával szemben; toxikus adagnak viszont azt a koncentrációt tekintjük, amelynél a vizsgált hatóanyag a sejt-tenyészetek 50%-án mutat felismerhető toxikus hatást. A találmány szerinti eljárással kapott komplex 60 vírusellenes hatóanyag, valamint az ebből elkülönített illetőleg a fent ismertetett egyéb módokon nyert vírusellenes hatású vegyületek, 0,25 mcg/ml vagy ennél alacsonyabb koncentrációban már gátolják a 2. típusú rhino-vírus fejlődését, anélkül, hogy ugyanak-65 kor bármilyen látható toxikus hatást fejtenének ki a legkisebb hatásos adag tízszeresének megfelelő adagolásban a sejt-tenyészetekre. 6
