167530. lajstromszámú szabadalom • Eljárás xilosztaszin előállítására
11 167530 12 2. táblázat folytatása 1. példa Legkisebb Vizsgált organizmus növekedésgátló konc, gamma/ml Mycobacterium avium (neomicin-rezisztens) 50 Mycobacterium phlei IFO 3158 1,6 Mycobacterium smegmatis IFO 3083 1,6 Megjegyzés: FDA: „Food and Drug Administration", Washington, D. C, , USA. PCI: „Penicillin Control and Immunology Section, Food and Drug Administration", Washington, D. C, USA. Glicerin-bouillon-agaron tenyésztett Bacillus sp. Y-399 törzzsel a következő összetételű táptalajt 5 oltjuk: Polipepton Húskivonat Nátriumklorid 3% 1% 0,5% 10 A táptalaj pH-ját 7,2-re állítjuk be. Az oltást követően 40 órán át 28 C° hőmérsékleten rázatjuk a tenyészetet. Ezzel az inokulum-15 mai 50 literes készülékben 30 liter főfermentációs táptalajt oltunk. Ennek összetétele a következő: 20 Glükóz 1% Polipepton 1% Húskivonat 0,7% MgS04 0,5% A táptalaj pH-ját 7,5-re állítjuk be. A kísérletekben bouillon-agart használtunk a közönséges baktériumok, míg glicerin-bouillon-agart a saválló baktériumok vizsgálatára. A találmány szerinti eljárással előállított új antibiotikum, a xilosztaszin akut toxicitását egereken, a hatóanyagot intravénás injekcióval adagolva vizsgáltuk. A xilosztaszin szabad bázis LD5 o -értéke közelítőleg 1000 mg/kg. A xilosztaszin in vivo baktériumellenes hatását egereken vizsgáljuk. Az egereket Escherichia coli 0-111 baktériumokkal fertőzzük, és a fertőzést követően azonnal, egy adagban, vizes oldatban, szubkután 10 mg/testsúlykilogramm xilosztaszint adunk az állatoknak. A kezelt egerek kivétel nélkül életben maradnak. A találmány szerinti eljárással előállított xilosztaszin és ennek gyógyászati szempontból elfogadható sói a baktériumok okozta fertőzések ellen hatásosan használhatók, ugyanakkor emlősökben toxicitásuk rerídkívül alacsony. Ezért biztonságosan és hatékonyan használhatók a baktériumok okozta fertőzéses megbetegedések kezelésére, például húgyutak fertőzéseinek, a bronchopneumonia, a pyelitis és az angina tonsillaris gyógyítására. 25 Az oltáshoz 3 liter inokulumot használunk. Az oltást követően 28 C° hőmérsékleten 66 órán át tenyésztjük az organizmust, miközben percenként 30 liter levegőt buborékoltatunk át a táptalajon, keverés: 200 fordulat/perc. 30 A tenyészlé pH-ját ezután telített, vizes oxálsav oldattal 1 és 2 közé állítjuk be és 300 g Hyflo-Supercel (Johns-Manville Products Co.) szűrési segédanyag hozzáadása után szűrjük. A 35 szűrlet pH-ját 7-re állítjuk be és 2 liter Amberlite IRC-50 (NH4 -ciklus) kationcserélő gyantával készült oszlopon engedjük át, amikor a hatóanyag adszorbeálódik. A gyantát először vízzel mossuk, majd a hatóanyagot 5%-os vizes ammóniumoldattal 40 eluáljuk. A 2,5 liter térfogatú aktív frakciót elkülönítjük és 600 ml kromatográfiás minőségű aktív szén szuszpenzióból készült oszlopon csurgatjuk át, amikor a hatóanyag adszorbeálódik. Vízzel mossuk az oszlopot, majd a xilosztaszint 0,3 n 45 vizes hidrogénklorid oldattal eluáljuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, Amberlite IR-45 (Rohm and Haas Co., OH" -ciklus) ioncserélő gyantával semlegesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékként kapott sűrítményt 50 liofilizálva 5,6 g nyersterméket kapunk. Ennek xilosztaszin-tartalma: 30%. A xilosztaszint általában parenterálisan adagoljuk, de nem parenterálisan is bejuttathatjuk a szervezetbe. A hatásos mennyiség a kezelendő 55 betegség tüneteitől függ. Általában esetenként például testsúlykilogrammonként 10 mg és 40 mg közötti mennyiséget adagolunk. A találmány szerinti eljárással előállított új 60 antibiotikumot, a xilosztaszint bármely ismert gyógyászati készítményben, például injekcióként, tablettaként vagy kenőcsként alkalmazhatjuk. A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal szemléltetjük. 65 Az előzőek szerint kapott nyerstermék 9,6 g-ját vízben oldjuk, az oldatot 150 ml Amberlite CG-50 (Rohm and Haas Co., NH4 + -ciklus) kationcserélő gyantából készült oszlopon engedjük át. Vizes mosás után 0,2 n vizes ammóniumoldattal eluáljuk a hatóanyagot. Az aktív frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékként kapott sűrítményhez acetont adunk, a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük. Halványsárga színű, porszerű termékként 3,0 g 90% xilosztaszint tartalmazó anyagot kapunk. Ezt vízben oldjuk, az oldatot CM-Sephadex C-25 (NH4 + -ciklus) kationcser élő gyantából készült, 6
