167528. lajstromszámú szabadalom • Eljárás G-418, verdamicin I, sziszomicin és gentamicin A antibiotikumokat tartalmazó keverék és alkotórészei előállítására
13 167528 14 A Micromonospora griseával végzett fermentáció A fermentálást a mikroorganizmusok tenyésztésével történő antibiotikum-előállítás szokásos módszerei szerint végezzük. Az antibiotikumok lényeges mennyiségben akkor keletkeznek, ha a mikroorganizmust asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó vizes táptalajban, előnyösen süllyesztett aerób körülmények között tenyésztjük. Asszimilálható szénforrások például a szénhidrátok, például a 3. táblázatban felsoroltak, különösen a glükóz, xilóz és mannóz. Asszimilálható nitrogénforrások például a fehérjék és az aminosavak, illetve ezeket tartalmazó anyagok, például marhahúskivonat, élesztőkivonat és szójababliszt. Jó tenyésztés és jó antibiotikum termelés érhető el az 1—3. példákban leírt fermentáló eljárásokkal. Az antibiotikum termelés fokozására a táptalajt szervetlen sók, például magnéziumszulfát, vas(II)szuífát és különösen kobaltklorid nyomnyi mennyiségeivel lehet kiegészíteni. A fermentálást rendszerint két vagy három szakaszban hajtjuk végre, az első vagy az első két szakasz az alkalmas oltóanyag előállítására szükséges mikroorganizmus elszaporítására szolgál. Általános szabály, hogy" a nagy fermentáló kádak alkalmazásakor két szaporító szakaszra, míg a fermentáló rázólombikok alkalmazásakor csak egy szaporító szakaszra van szükség. A szaporítást aerób körülmények között, keverés közben végezzük, előnyösen például 250-400 percenkénti fordulattal, rendszerint 25-35 C°-on, 1-4 napig keverjük a fermentlét. Az utolsó fermentáló szakasz, a termelő szakasz, azzal kezdődik, hogy az alkalmas táptalajt steril körülmények között beoltjuk az előzőleg előállított oltóanyaggal. A fermentálás termelő szakaszában rendszerint ugyanolyan hőmérsékletet alkalmazunk, mint a szaporító szakaszban. A legnagyobb aktivitás elérésére rendszerint 4—7 nap szükséges. A szaporító szakaszban a pH általában állandó marad, viszont a termelő szakaszban a pH 7,2 és 8,3 közötti beszabályozására van szükség. A fermentálás során, különösen az első 24 óra után alkalmas időközökben (például minden 6—8 órában) mintavételekkel kell meghatározni, hogy a tenyészet mikor éri el a legnagyobb antibiotikus aktivitást. A meghatározást előnyösen a szokásos agar lemezeken korongpróbával végezzük, előírt táptalajt és mikroorganizmust használva. Az előnyös módszer összes részleteit a továbbiakban írjuk le. Az antibiotikumok elkülönítése Amikor a fermentleben a legnagyobb hatóképesség kialakult, a terméket rendszerint a megsavanyítást, szűrés, adszorpció, eluálás és bepárlás, illetőleg liofilizálás műveleteinek kombinálásával összegyűjtjük. Az egyik előnyös elkülönítési módszerben a jelenlevő kalciumionokat oldhatatlan sóként kicsapjuk, a fermentlé egészét megsavanyítjuk, előnyösen ásványi savval, és a fermentált keveréket szűrőre visszük, vagy centrifugáljuk. Közömbösítés után az antibiotikum terméket alkalmas kationcserélő gyantán, például ammónium alakjában levő gyengén savas ioncserélő gyantán adszorbeáltatjuk, híg lúggal, előnyösen ammónium-5 hidroxid-oldattal eluáljuk, és bepárlással, illetőleg liofilizálással elkülönítjük. Egy különösen előnyös eljárásban a fermentléhez 5-8 g/liter arányban oxálsavat adunk, hogy a kalciumot oldhatatlan oxalátként kicsapjuk, majd 10 erős ásványi savval, például 6 n kénsawal a fermentlé pH-ját 2,0-re állítjuk be, hogy az antibiotikumot felszabadítsuk a micéliumból. A fermentlé megszűrése után a szüredéket ammóniumhidroxiddal közömbösítjük, az antibiotikumot 15 Amberlite IRC-50NH4 + 0,1-0,04 mm szemcsenagyságú ioncserélő gyantán (Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania) adszorbeáltatjuk, és a kimerült fermentlét kiontjuk. Az antibiotikum keveréket a gyantából lúggal, előnyösen 2 n amraó-20 niumhidroxid-oldattal mossuk ki. Az eluátumot vákuumban kis térfogatra koncentráljuk, és liofilizálással szárazra pároljuk. A Micromonospora grisea tenyésztésével 25 előállított antibiotikumok Az antibiotikumok kimutatását és a frakciók homogenitását papírkromatografálással határoztuk meg két módszer szerint: 1. kémszerek haszná-30 latával és 2. mikrobiális eljárással. Az első módszerben 0,25% ninhidrint tartalmazó piridin-aceton eleggyel permeteztük, majd 105 C°-ra melegítettük a kromatogramot. Az antibiotikum frakciók a fehér alapon színes foltokként jelennek meg. 35 Az antibiotikum frakciókat mikrobiális úton úgy mutattuk ki, hogy Staphylococcus aureus ATCC 6538P mikroorganizmussal beoltott agar lemezre helyeztük a papírlapot. 10 perc múlva a papírt 40 eltávolítottuk, és alkalmas inkubálási idő (általában 16—18 óra) után megfigyeltük az antibiotikumokra jellemző gátlás területeit. Ezek és más hasonló próbák eredményei azt mutatták, hogy a fent leírt fermentáló módszerrel kapott antibiotikum több 45 alkotórészből áll, ezeket a találmányi leírás következő szakaszaiban ,,négy fő alkotórész"-ként említjük. Az elválasztást a szakértő előtt jól ismert módszerekkel, például ellenáramú extrahálással vagy 50 ioncserélő gyantákon vagy más szilárd adszorbenseken, mint amilyen a kovasavgél, kromoszorb vagy cellulóz, való kromatografálással végeztük. Előnyös a kromatografálást kovasavgélen végezni. A négy fő alkotórész közül az első kettőt kloroform, 55 izopropanol és tömény ammóniumhidroxid 2:1:1 térfogatarányú keverékének alsó fázisával eluáltuk, ugyanezen oldószerek 1:1:1 arányú keverékének alsó fázisával folytattuk tovább az eluálást a többi antibiotikum teljes deszorpciójáig. 60 A különféle fizikai, kémiai és biológiai adatokból megállapítható a négy fő alkotórész mibenléte: 1. Verdamicin I, egy eddig ismeretlen anti-65 biotikum. 7
