167464. lajstromszámú szabadalom • Eljárás passzív haemaglutináció gátláson alapuló rekació céljaira alkalmas liofilezett vörösvértest szuszpenzió előállítására

3 167464 4 Hirata, A. A. és munkatársai Proc. Soc. Exp. Biol. 1969, 130. 343. a vörösvértest szuszpenziót először piroszőlősav-aldehiddel, majd formaldehiddel kezelik, ezt követően pedig bovin szérum albuminnal 4 pH értéken reagáltatják. Az antigént tartalmazó vörösvértest szuszpenzió tisztítására többszöri fagyasztást és felolvasztást alkalmaznak, és az előállított reagenst —196C°-on tárolják. Petchclai, B. és munkatársai Am. J. Clin. Path. 1970, 54, 810. a gátló antigén kvantitatív meghatározására alkalmas mikrotitrátor rendszerben alkalmazható mikromódszert dolgoztak ki a humán choriogonadotrop hormon meghatározására. Ebből a célból a vörösvértest szuszpenzióhoz először a humán choriongonadotrop hormont, ezt követően a glutáraldehidet adják hozzá. Az antigént tartalmazó'* szuszpenziót tárolás céljából nem liofilezik, hanem egy hónapig +4 C°-on tárolják. A közölt módszerrel előállított reagens érzékenysége korlátozott, liofilezhetősége sem kifogástalan. * Azt találtuk, hogy ha a hordozóként alkalmazott vöröfivértestet a speciális kötőanyaggal éspedig a glutáraldehiddel aktiváljuk, akkor a humán choriongonadotrop felvétele szempontjából optimális reagenst kapunk, amelynek stabilitása fokozott, jól liofilezhető, így tárolható antigént tartalmazó vörösvértest szuszpenzió előállítására alkalmas. Ezzel szemben, ha a hordozót a kötendő antigénnel előzetesen hozzuk össze és utóbb adagoljuk a, kötőanyagot - mint ezt a módszert javasolják a szakirodalomban - akkor a kapott készítmény instabil, liofilezhetősége sem kielégítő. A megfelelő minőségű reagens előállítása természetesen nagy mértékben függ az alkalmazott reakciókörülményektől és felismerésünk szerint a vörösvértest szuszpenzió minőségétől is. A találmány célkitűzése a passzív haemaglutináció gátláson alapuló reakció céljaira alkalmas liofilezett vörösvértest szuszpenzió előállítása viszonylag egyszerű technológia alkalmazásával, továbbá annak biztosítása, hogy az előállított szuszpenzió érzékenységének változása nélkül tárolható legyen. A találmány szerinti eljárás tárolható, humán choriogonadotrop hormon immunokémiai úton, passzív haemaglutináció gátlása útján történő meghatározására alkalmas vörösvértest szuszpenziók előállítására liofilezés útján azzal jellemezhető, hogy célszerűen a hormon felvevőképesség szempontjából szelektált, legfeljebb 10% vörösvértestet tartalmazó", aspecifikus agglutinációtól mentes emlős vagy emberi vörösvértest-szuszpenziót a choriogonadotrop hormonnal való reagáltatás előtt 0,1-1,0 g/ml koncentrációban glutáraldehiddel kezeljük 5,0 és 8,0 pH közötti értéken +10 és +40 C° között, majd a choriogonadotrop hormont 200-8000 NE/ml mennyiségben tartalmazó vörösvértest szuszpenziót adott esetben adjuvánsok, célszerűen cukor, tisztított szérum fehérje, zselatin, vagy pepton 0,1-1,0%-nyi mennyiségének hozzáadása után fagyasztó szárításnak vetjük alá. A fagyasztó szárítást a találmány szerint előnyösen úgy végezzük, hogy a rázassál homogenizált choriogonadotrop hormont tartalmazó vörösvértest szuszpenziót hirtelen —80 C° körüli hőmérsékletre lehűtjük, majd az anyaghőmérsékletet 24 óra leforgása alatt fokozatosan szobahőmérsékletre hagyjuk emelkedni. A találmány szerinti eljárással előállított humán 5 choriogonadotrop hormont tartalmazó vörösvértest-szuszpenziók előállítása ezáltal egyszerűsíthető és az ismert módszerek bármelyikéhez képest magasabb haemaglutinációs titert és liofilezhetőséget érünk el. A magasabb haemaglutinációs titer 10 előnye, hogy a gátlási titráláshoz lényegesen kisebb mennyiségű immunsavó szükséges és a reakció érzékenysége fokozható. Az eljárás kivitelezésénél az alkalmas vörösvértestek szelektálását a hormonfelvevőképesség szem-15 pontjából az alábbi módon végezzük: a megfelelő állatfaj kiválasztása után egészséges, előzetesen a szükséges védőoltásokkal a szokásos járványos megbetegedések ellen védetté tett állatokat megfelelő körülmények között, jó takarmányozással 20 tartunk állandó állatorvosi felügyelet mellett. Az állatoktól több hónapon keresztül hetente steril Alsever-oldatba (Orvosi Lexikon, Akadémia Kiadó, 1967. 124. oldal) steril körülmények között vénás punkcióval vért veszünk. Az Alsever-oldat és a vér 25 aránya 2:3. Az Alsever-oldat és a vér egyenletes keveredését lassú rázassál biztosítjuk. A tartósított vért egy hétig +4 C°-on tároljuk. Tárolás után a vért steril fiziológiás NaCl oldattal kimossuk. A mosott vörösvértesteket a megfelelő koncentráció-30 ban glutáraldehiddel kezeljük, majd HCG-t kötünk hozzá. Ezután passzív haemagglutinációval, illetve passzív haemagglutináció gátlással ellenőrizzük a vér hormonfelvevő képességét. (A standard immunsavó minél nagyobb hígításával ad agglutinációt a 35 reagens annál nagyobb a vörösvértest hormonfelvevő képessége.) A hormonfelvevő képesség más biológiai paraméterek mérésével nem megközelíthető, semmilyen korrelációban sem áll az általunk mért többféle vizsgálati eredménnyel 40 (vörösvértestszám, vérsejtsüllyedés, haemaglobin szint, haematokrit vagy egyéb szérum összetevők koncentrációja). Az egy fajon belüli egyes állatok között erős eltérések vannak, amely eltérés még szezonális ingadozást is mutat, szintén egyedenként 45 változó mértékben. Tartós felhasználásra, összehasonlító vizsgálatokra csak az az állat alkalmas, amely vörösvértestjeihez a legkisebb szezonális ingadozás mellett köthető a HCG és a standard immunsavó legalább 1 :1000 hígításával is mindig 50 pozitív agglutinációt ad a reagens úgy, hogy emellett a reagens a szelekció időtartalma alatt aspecifikus agglutinációt egyáltalában nem mutatott. A szelektálás után a megfelelő állattól származó vörösvértesteket alaposan kimossuk és 55 foszfát, vagy foszfát-NaCl puffer rendszerben (pH 6,0-7,4 között, foszfát koncentráció 0,01 M-0,2 M, NaCl koncentráció 0,05-0,2 M) szuszpendáljuk úgy, hogy ebben a mosott vörösvértestek koncentrációja 5—10% közötti 60 legyen. A glutáraldehid kereskedelmi forgalomban levő reagens alakjában alkalmazható: A puff érrendszerben szuszpendált vörösvértestekhez állandó lassú keverés mellett cseppenként adjuk hozzá a glutáraldehidet úgy, hogy annak végkoncentrációja 65 a rendszerben 0,1-1,0 gr/ml között legyen. i