167464. lajstromszámú szabadalom • Eljárás passzív haemaglutináció gátláson alapuló rekació céljaira alkalmas liofilezett vörösvértest szuszpenzió előállítására

5 167464 6 Az előbbi eljárás során készült, glutáraldehiddel kezelt vörösvértestekhez adjuk hozzá a hormont, az anyag tisztaságától függő mennyiségben, úgy, hogy végkoncentrációja 200-8000 NE/ml közötti legyen. Állandó keverés mellett a pufferoldatban a 5 kötési idő célszerűen 1 óra, a hőmérséklet 24 C°. A kötött rendszert szükség szerint liofilezésnek vetjük alá. A készítmény megf

eWő konzerválószer jelenlétében +4 C°-on is hosszabb ideig tárolható anélkül, hogy a szuszpenzió haemagglutinációs 10 titerében változás következne be vagy a vörösvértestek spontán agglutinációra vagy haemolízisre hajlamossá válnának. Célszerűen a készítményt liofilezve tároljuk. A fagyasztó szárításnak alávetett szuszpenzió 15 összetétele: A kezelés, kötés után kimosott vörösvértesteket szuszpendáljuk maximum 10% végkoncentrációban a következő adjuvánsok valamelyikét tartalmazó. oldatban: 20 cukrok — leginkább szaharóz vagy laktóz 5-15% vagy szérum fehérjék — leginkább albumin 0,2-2,0% 25 vagy zselatin 0,1-1,0% vagy polivinil-pirrolidon 0,1-1,0% vagy pepton, leginkább Bacto-pepton 0,5-2,0% vagy foszfát puffer pH 6,0-7,4 30 0,01-0,2 M desztillált vízben oldva. A liofilezésnél az anyaghőmérsékletét hirtelen —80 C°-ra lehűtjük, majd fokozatosan 24 óra leforgása alatt hagyjuk az anyaghőmérsékletet 35 szobahőmérsékletre emelkedni. A terhesség diagnosztizálása passzív haemaglutináció gátlással a következő módon történhet. A vizsgálandó vizeletet az előzetesen titrált mennyiségű immunsavóval összehozzuk. Az immun- 40 savót nyulakban termeljük. A humán ehoriogonadotrop hormon fehérjetermészetű, jó immunogén tulajdonságokkal rendelkező antigén. A humán choriogonadotrop hormon elleni szérum termelésé- > nél a nyulakat 0,85%-os nátriumklorid oldatban 45 komplett Freund-adjuvánssal azonos mennyiségben elkevert humán choriogonadotrop hormonnal oltjuk ismert oltási séma szerint. Az egyszeri oltáshoz 1 000-15 000 NE adagot alkalmazunk. Az immuni" zálási folyamat végén egyszerre elvéreztetjük az "50 állatokat vagy több alkalommal vért veszünk. Az összegyűjtött megfelelő titerű immunsavóból célszerűen a zavaró, aspecifikus antigénekre ható antitesteket eltávolítjuk, mivel a rutinszerű immunizálásra használt humán choriogonadotrop-készít- 55 menyek fehérjetermészetű egyéb szennyező anyagokat tartalmaznak. Az immunsavóval kezelt vizelethez hozzáadjuk a találmány szerinti modort készült vörösvértest-szuszpenziót. Ha a vizsgálandó vizelet humán choriogonadotrop hormont tartalmaz, akkor 60 a vörösvértestek gömb vagy gyűrűszerűén a cső alján leülepednek, az agglutináció gátlása miatt a reakció negatív. Ha azonban a vizsgált vizelet nem tartalmaz humán choriogonadotrop hormont, akkor a vörösvértestek a cső alján szétterülnek, a reakció 65 pozitív, mert agglutináció jött létre, vagyis a vizsgálandó egyén nem terhes. A reakciót speciálisan kiképzett csőben vagy ampullában végezzük. A vizsgálatoknak legjobban megfelelő átmérőjű speciális gömgfenekű csöveket alkalmazunk. Ilyen speciális ampullában végezve a reagens liofilezését a kivitelezés pontos egyszerű és megbízható, a lehető legkevesebb manipulációt igényli a felhasználó részéről. A találmány szerinti eljárást közelebbről a következő példákban ismertetjük: 1. példa Juh vörösvértesteket 20-szoros térfogatú 0,85%-os nátriumklorid oldattal háromszor mossuk, majd pH 7,2 értékű foszfátpuff erben szuszpendáljuk úgy, hogy a vörösvértestek végkoncentrációja a puffer oldatban 10% legyen. A szuszpenzióhoz glutáraldehidet adunk cseppenként úgy, hogy a glutáraldehid végkoncentrációja 0,25 g/ml legyen. A kezelt vörösvértestekhez egyenlő térfogatú 4000 NE/ml előbbivel azonos pufferoldattal készített choriogonadotrop hormon oldatot adunk állandó keverés mellett, cseppenként. A keveréket 37,5 C°-on 1 órát állni hagyjuk, majd a vörösvértesteket háromszor a puffer oldattal kimossuk. Ezután pH 7,2 értékű 0,01 M foszfát oldatban szuszpendáljuk úgy, hogy a vörösvértest koncentrációja 10% legyen és liofilezzük. A liofilezést ampullában végezzük gyors —80 C° körüli hőmérsékletre való lehűtés után. A reagens készítésénél a liofilezést speciális ampullában végezzük, ily módon a vizsgálandó vizeletből 0,1 ml hozzáadása elegendő és a reakció további manipulációt nem igényel. Ezáltal lehetővé válik a hormon gyors kvalitatív, szükség esetén kvantitatív meghatározása is. 2. példa Az 1. példa szerint előkészített vörösvértesteket pH 6^5 értékű foszfát-nátriumklorid puffer oldatban szuszpendáljuk, glutáraldehidet adunk hozzá olyan mennyiségben, hogy l g/ml végkoncentrációja legyen. A humán choriogonadotrop oldatot 1000 NE/ml koncentrációban alkalmazzuk. Az elegyet 3 óra hosszat 24 C°-on állni hagyjuk, majd háromszori mosás után 2% Bacto-peptont tartalmazó desztillált vízben szuszpendáljuk úgy, hogy a vörösvértest végkoncentrációja 5% legyen és liofílezzük. A liofilezésnél a reagenst enyhe rázassál homogenizáljuk, majd hirtelen -80 C°-ra lehűtjük és . fokonként emeljük az anyag hőmérsékletét először 0 C°, majd +25 C°-ig, ily módon 24órára elnyújtjuk a liofilezést. A készítmény liofilezés után a különböző hődegradiációs vizsgálatokat az immunológiai tulajdonságok változása nélkül viselte el, több hónapig -15C°-on, 6 hétig +32 C°-on, 1 hétig +56 C° és 10 percig +100 C°-on tároltuk a készítményt. A degradációs vizsgálatok végeredményeképpen azt jelzik, hogy a készítmény teljesen stabil. 3