167369. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lazac kalcitonin és származékai savaddiciós sóinak előállítására
31 167369 32 -15 és -20° között tartva hozzáadunk 4,5 ml trietilamint, és az oldatot hozzászűrjük H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 dimetilformamiddal készült hideg oldatához. 0°-on való 2 órai keverés után az oldatot vákuumban 5 koncentráljuk, etilacetátot adunk hozzá, és a keletkezett csapadékot szűréssel elválasztjuk. A kapott nyers terméket metanol-kloroform-víz elegyében oldjuk, és felvisszük egy kovasavgéloszlopra. Az oszlopot eluáljuk, a tiszta frakciókat egyesítjük, 10 és vákuumban teljesen bepároljuk. így 150 -on olvadó Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asp-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2-t kapunk. [a]£°=-52° (c=l, metanolban), -27,0? ' (c=l, dimetilformamidban). 15 ABC2 2 részsorozat: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Asp(OTB)-Leu-His-Lys(BOC)- 20 -Leu-Gln-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 4,6 g hexadekapeptidet (ABC2 részsorozat) feloldunk 250 ml vizes metanolban hozzáadunk 2,1 g 25 kevés vízben szuszpendált 10%-os palládiumszenet, és katalitikusan hidrogénezzük. Hidrogénezés után a katalizátort kiszűrjük, és a szüredéket teljesen bepároljuk. 30 3,04 g heptapeptidet (D2 részsorozat) feloldunk 20 ml dimetilformamidban, az oldatot — 20°-ra hűtjük, és hozzáadunk 1,53 ml 5,87 n éteres hidrogénklorid-oldatot, és 0,31 ml terc-butilnitritet. A keveréket meg 5 percig keverjük, majd 1,26 ml 35 trietilaminnal közömbösítjük. A fenti hidrogénezéssel kapott hexadekapeptidet — 30°-ra hűtjük, és hozzászűrjük a heptaazid-oldatot. Ezután a reakciókeveréket néhány óra hosszat állni hagyjuk, majd teljesen bepároljuk. A maradékot etilacetát hozzá- 40 adásával kicsapjuk. A nyers terméket kovasavgéloszlopon krömatografáljuk, és kloroform-metanol-víz eleggyel eluáljuk. így a 170°-on bomlás közben olvadó cím szerinti vegyületet kapjuk. [a]D°=-H,6° (c =1, dimetilformamidban). 45 EF részsorozat: BOC-Cyl-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val- 50 -Leu-OH 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 (F részsorozat) 150 ml dimetilformamiddal készült oldatát —20°-ra hűtjük, és hozzáadunk 55 40 ml 2 n dioxános hidrogénklorid-oldatot és 15 ml terc-butilnitritet. Tíz perc múlva —20°-on hozzáadunk még 28 ml trietilamint és 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH-t (E részsorozat), és 16 óra hosszat 25°-on keverjük. Ezután az oldatot 60 leszűrjük, bepároljuk, és a maradékot n-ecetsawal mossuk. így 217° olvadáspontú BOC—Cys(Bzl)— Ser -Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH-t kapunk. [a]D°=-17° (c=l, dimetilformamidban). Az így kapott terméket 5 liter vízmentes ammó- 65 niában oldjuk, keverés és az ammónia forrása közben fémnátriumot adunk hozzá sötétkék színeződésig. Ezután elszíntelenítésre ammóniumkloridot adunk az oldathoz, teljesen bepároljuk, és a maradékot n-ecetsawal és acetonnal mossuk. Szárítás után 248°-on bomlás közben olvadó BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Thr-Cys-Val-Leu-OH-t kapunk, [aß0 =-41° (c=l, 3:1 arányú dimetilformamid-víz elegyben). Az így kapott nonapeptidet 5 liter 0,01 n vizes ammóniaoldatban oldjuk, keverés közben n vizes hidrogénperoxid-oldatot adunk hozzá, amíg nitroprussziát-reakció negatívvá nem válik, majd még 200 ml jégecetet adunk hozzá, a reakciókeveréket szűrőre visszük, és a szüredéket liofilizáljuk. így bomlás közben 238°-on olvadó BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH-t kapunk. [á\l° =-18° (c=l, 3:1 arányú dimetilformamid-víz elegyben). H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-ThrCys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser—Gin—Asp-Leu-His-Lys— -Leu-Gm-Thr-Phe-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 6AcOH • H2 0 900 mg trikozapeptidet (ABC2 D 2 részsorozat) feloldunk 70 ml 60%-os ecetsavban, és szobahőmérsékleten 20 óra hosszat állni hagyjuk. A reakciókeverékhez vizet adunk, és éterrel többször mossuk. A vizes fázist acetátfázisú Amberlit IRA 410 oszlopon átszűrjük, majd az oldatot teljesen bepároljuk. l,0mg nonapeptidet (EF részsorozat) 10 ml dimetilformamidban oldunk, hozzáadunk 169 mg N-hidroxi-szukcinimidet és 0,52 g diciklohexilkarbodiimidet, az oldatot 6 óra hosszat 25°-on keverjük, szűrjük, és a szüredéket teljesen bepároljuk. A maradékot etilacetáttal és dietiléterrel mossuk, és megszárítjuk. Az így kapott 242°-on olvadó BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH-t 10 ml dimetilformamidban oldjuk. A fenti, a védőcsoport^ lehasítása után kapott trikozapeptidet 5 ml dimetilformamidban oldjuk, és hozzáadjuk a nonapeptidoldathoz. Szobahőmérsékleten való 48 órai állás után a terméket etilacetáttal kicsapjuk. A terméket centrifugáljuk, dekantáljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, centrifugáljuk, és ismét dekantáljuk. Leszivatás és szárítás után a kapott 145 mg védett nyers dotriakontapeptidet 3 ml metilénklorid-trifluorecetsav-víz elegyben oldjuk. Az oldathoz 1 órai állás után étert adunk, a csapadékot centrifugáljuk. és éterrel szárítjuk. A maradékot 18 ml 0,2 n ecetsavban oldjuk, és P6 biogél-oszlopra (1 x 300 cm) rétegezzük. Az eluálást 0,2 n ecetsavval végezzük. Az egyesített tiszta frakciókat bepároljuk, majd liofilizáljuk. A cím szerinti vegyületet kapunk. HD°=-72,9° (c= 1, n ecetsavban). 16
