167360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mindkét láncvégen alfa-aminooxi-karbonsavat tartalmazó ACTH hatású polipeptidek előállítására
13 167360 2. 'epés: D-a-terc-butfloxikprbonil-aminooxi-e-formilamino-kapronsavamid -[BOC-D-OLys(For)-NH2 ] 5,0 g (17,2mniól) BOC-D-OLy&(For)-ből /kiindulva az 1. példában leírt módszer szerint 4,4 (88%) BÖC-D-OLys(For)-NH2 -ot kapunk. R?=0,54. 3. lépés: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GluíGBu1 )-ÍEs-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Vaí-G?y-Lys(BCC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D•OLys(For)-NHi 0,57 g (1,97 mmól) BOC-D-OLys(For)-NH2 -ból kiindulva az 1. példa 11. lépésében leírt módszer szerint 0,90 g (85%) védett, aminooxikaibonsavval helyettesített oktadekapeptidamidot kapunk, op.: 140-145 C°, R? =0,47. 3. példa H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Tip-Gly Lys-P-o Vaí-Gly-Lys-Lys-Lys-OLys-NH2 1,2 g (0,417 mmói) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBuO-His-Phe-Arg-Trp-Giy-Lys(BQC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Iys(30C>Lys(BOC)-OLys(ßOC)-NH2-t fe'oldunk 9,6 ml trifluorecetsav, 1,2 ml víz és 1,2 ml anizoí elegyében, majd az oldatot egy órai állás után 240 ml éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, foszforpentoxid és káHumhiüroxid mellett vákuumban szárítjuk. l,10g (84%) aminooxikarborjsawal helyettesített oktadekapeptidamid-trifluoracetátot kapunk. A nyers trifluoracetátot 20 ml vízben oldjuk, a trifluoracetát ionokat acetát ciklusú Dowex 1x8 ioncserélő gyantával (Röhm and Haas cég) acetát ionokra cseréljük. Az így kapott oldatot karboximetilcellulóz (Whatman CM-52) ioncserélőből készített 4,5 x 65 cm-es oszlopra öntjük, majd 2 Üter 0,2 mól (pH 6,7) és 2 liter 0,5 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferből készített lineáris puffergradienssel 80 ml/óra sebességgel eluáljuk. A terméket tartalmazó 98-115. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. 0,49 g (41%) aminooxikarbonsawal helyettesített oktadekapeptidamidot kapunk, peptid tartalom: 78% (UV elnyelés alapján), Met-szulfoxid tartalom: 2,3%, Tyr/Trp arány: 1,10, aminosavanalízis: Lys 3,5 (4), His 0,9 (1), Arg 1,0 (1), Ser 0,85 (1), Glu 1,0 (1), Pro 1,0 (1), Gly 1,9 (2), Val 0,9 (1), Met 0,7 (1), Tyr 0,9 (1), Phe 1,0 (1), R?=0,18. A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesített oktapeptidamidot az alábbi módszerrel készítjük: 1. lépés: L-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-benziloxi-karbonil-ammo-5 -kapronsav-diciklohexilamin só [BOC-OLys(Z)-OH • DCHA] N-e-benziloxikarbonil-D-lizinből állítjuk elő az 1. példa 1. lépésében leírt eljárás szerint. A kapott 10 olajos L-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-benziloxikarbonil-amino-kapronsavat éterben oldjuk és diciklohexilaminnal sóvá alakítjuk. Op.: 158-161 C° (etanol-vízből átkristályosítva), R^=0,15, [a]D = -34,6° (s = l, etanol). 15 2. lépés: L-a terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-benziloxikarbonil-amino-20 -kapronsavamid ÍBOC-OLys(Z)-NH2 j L-u-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-benziloxikarbonil-amiiio-kapronsav-diciklohexilamin sót éter és 1 n kénsav között megosztunk és az éteres oldat 25 bepárlásával nyert savat az 1. példa 2. lépésében leírt eljárás szerint amidáljuk. A reakcióelegy bepárlása után a nyers teiméket oszlopkromatográfiás tisztítás heiyett eti1 acetátban oldjuk é* vízzel, 1 n kénsawal végül 8%-os nátriumhidrogénkarbonát-ol-30 dattal mossuk. Az etilacetátos oldat bepárlása után sűrű claj formájában kapjuk meg az L-a-ierc-butiln xi karbonil-arrinooxi-e-benziloxikarb onil-amino-kapronsavamidot. Op.: 93-95 C° (metanol-vízből áíkristályosítva), R|=0,42, [a]D =-27,5° (c = l, me-35 tanol). 3. lépés: L-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-40 -e-amino-kapronsavamid-oxalát (BOC-OLys-NHj-oxalát 12,0 g (30,4 mmól) BOC-OLys(Z>NH2 -ot feloldunk 240 ml metanolban, 3,0 g (33,3 mmól) 45 vízmentes oxálsavat adunk hozzá és 2,0 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, a szűrletet bepárolji'k és a maradékot éterrel eldörzsöljük. A nyers oxalátot 50 (9,3 g) 45 ml metanol és 95 ml éter elegyéből átkristályosítva 8,7 g (81,5%) L-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-e-amino-kapronsavamid-oxalátot kapunk. Op.: 153-155 C°, R?=0,30, [a]D = -38,l° (c = l, metanol). 55 4. lépés: La-aminooxi-eterc-butiloxikarbonil-amino-kapronsavamid 60 [H-OLys(BOC)-NH2 ] 8,0 g (22,8 mmól) BOC-OLys-NH2 • oxalátot 40 ml trifluorecetsavban feloldunk és az oldatot fél óra múlva csökkentett nyomáson bepároljuk. 65 Az olajos maradékot váltott éterrel mossuk, majd 7
