167360. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mindkét láncvégen alfa-aminooxi-karbonsavat tartalmazó ACTH hatású polipeptidek előállítására
11 167360 12 9. lépés: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC> -Lys(BOC)-OCH3 • HCl 1,25 g Z-Lys(BOC)-Lys(BOC>Lys(BOC)-OCH 3 -t 25 ml metanolban oldva 0,2 g 10%-os csontszenes palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezünk. A reakció befejeződése után a katalizátort kiszűrjük, a metanolt ledesztilláljuk és a visszamaradt tripeptidésztert 2,42 g (1,24 mmól) BOC-D-OSei-Tyr-Ser-Met-GluíOBuO-His-Phe-Arg^Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-OH • HCl-dal együtt 12 ml dimetilformamidban feloldjuk. Az oldatot 0,97 g (3,64 mmól) PCPOH és 0,255 g (1,24 mmól) DCC hozzáadása után 2 napig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ekkor a kivált DCU-t leszűrjük, a szűrletet vákuumban betöményítjük és a terméket éter hozzáadásával kicsapjuk. A szűrés és szárítás után kapott nyers terméket [3,4 g, op.: 177 C° (bomlik)] metanol-éterből kristályosítva 2,6 g (80%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített haptadekapeptid-metilészter-hidrokloridot kapunk, op.: 191 C° (bomlik), R?=0,54. 10. lépés: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GMOBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC>N2 H 3 2,5 g (0,93 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu^-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC>Pro-Val-Gly-Ly s(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH3 • HCl-ot feloldunk 75 ml forró metanolban. Az oldatot szobahőmérsékletre hűtjük és 0,91 ml (18,7 mmól) hidrazinhidrát hozzáadása után 2 napon át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ekkor a metanolt ledesztilláljuk és a maradékot éterrel el dörzsöljük. A nyers terméket [2,15 g, op.: 199 C° (bomlik)] dimetilformamid-vízből átcsapva 2,00 g (81%) védett, aminooxikarbonsawal helyettesített heptadekapeptidhidrazidot kapunk, op.: 205 C° (bomlik), Rf = 0,49. 11. lépés: BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GluíOBu*)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(DOC)-Lys(DOC)-Lys(BOC> -OLys(For)-NH2 a) 0,57 g (1,97 mmól) BOC-OLys(For)-NH2 -ot feloldunk 7,5 ml trifluorecetsavban. Félórás állás után az oldatot vákuumban bepároljuk és a maradékot 4 ml dimetilformamidban oldva diizopropil-etilaminnal semlegesítjük. b) l,00g (0,377 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC>Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-N2H 3 -ot enyhe melegítéssel feloldunk 5 ml dimetilformamidban. Az oldatot —20 C°-ra hűtjük és keverés közben becsepegtetünk 0,54 ml (1,52 mmól) 2,8 n etilacetátos sósav-oldatot, majd 0,05 ml (0,42 mmól) terc butilnitritet. A reakcióelegyet 5 percig -10C°on keverjük, majd -20 C° ra hűtjük és hozzáadjuk a fenti semlegesített 5 H-OLys(For)-NH2 trifluoracetát-oldat és 0,2 ml (1,17 mmól) diizopropil-etilamin elegyét. Areakcióelegyet 1 órán keresztül -5 és 0 C° közötti hőmérsékleten keverjük, majd másnapig 0 C -on állni hagyjuk. Ezután az oldószer felét ledesz 10 tilláljuk és a maradákot 20 ml vízzel meghígítjuk. A kicsapódó massza állás közben megszilárdul. Friss víz alatt elporítjuk, szűrjük, szárítjuk. 0,80 g (75,5%) védett, aminooxikarbonsawal helyettssített oktadekapeptidamidot kapunk, op.: 140—145 C°, 15 Rf = 0,47. 2. példa: 20 H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-\rg-TrpGly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-I,ys-Lys-D-OLys-NH2 0,75 g (0,267 mmól) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu*)-ffis-Pht-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC>Pio-Val-25 - Gly - Ly s( B OC)- Ly<BOC)-Lys(BOC>D-OLys(For) -NH2 -ot feloldunk 6 ml trifluorecetsav, 0,75 ml víz és 0,75 ml anizol elegyében, majd az oldatot 1 órás állás után 150 ml éterrel hígítjuk. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, foszforpentoxid és 30 káliumhidroxid mellett vákuumban szárítjuk. Az így kapott 0,65 g (80%) amiROoxikarboncawal helyettesített formil-okiadekapeptid-triftuoracetáiot feloldjuk 10 ml vízben, 0,25 ml merkaptoetanolt adunk hozzá, az cldat pH-ját n nátriumhidroxid 35 oldattal 5-re állítjuk, majd 10,6 ml 2 mól nidrazinacetát oldattal elegyítve 2 órán át 95 C°-os vízfürdőben tartjuk. Ekkor vákuumban besűrítjük és kaiboximetilcellulóz (Whatman CM 52) ioncserélőből készített 4,5 x 50 cm-es oszlopra öntjük, majd 40 2 liter 0,2 mól (pH 6,7) és 2 liter 0,5 mól (pH 6,7) ammóniumacetát pufferbol készített puftergradienssel 80 ml/óra sebességgel eluáljuk. A terméket tarialmczó 87-101. frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk, 0,28 g (41%) aminooxikarbonsawal 45 helyettesített oktadekapeptidamidoi kapunk. Rf=0: 18. A kiinduló anyagként használt védett, aminooxikarbonsawal helyettesíteti oktadekapeptid-50 amidot az alábbi módszerrel készítjük: 1. lépés: 55 D-a-terc-butiloxikarbonil-aminooxi-6-formilamino-kapronsav [BOC-D-OLys(For)] N-e-formil-L-lizinből állítjuk elő az 1. példa 1. lé-60 pésében leírt eljárás szerint. Op.: 114-116 C°. R? =0,31. [a]D =+58,6° (c= 1, metanol). Elemzés a Ci2 H 22 N 2 0« összegképlet alapján: számított: C = 49,6%, H = 7,65%, 65 talált: C = 50,0%, H = 7,6%. 6
