167359. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szénhidrát vagy aminosav tartalmú anyagok enzimatikus átalakítására
5 167359 6 aktivitásától, annak a szubsztráthoz való affinitásától, valamint a transzformáció kívánt mértékétől. Folyamatos oszlopos eljárásoknál az oszlop mérete és a szükséges átfolyási sebesség ugyancsak befolyásolja a szükséges enzim-tartalmú anyag mennyiségét. A szubsztrátot — előnyösen oldat vagy emulzió alakban - a koagulált anyaggal annyi ideig tartjuk érintkezésben, amely a kívánt transzformáció végbemeneteléhez szükséges. A transzformáció paramétereit, így a hőmérsékletet, pH-értéket és szubsztrát-koncentrációt a stabilitás és a transzformációhoz használt enzim optimális aktivitásának kifejtéséhez szükséges körülmények szabják meg. A transzformáció termékét bármely alkalmas módon elválaszthatjuk, vagy kívánt esetben további feldolgozásnak vethetjük alá. A találmány szerinti eljárást egy specifikus organizmusra és enzimre hivatkozva ismertetjük közelebbről. Valamely Arthrobacter-törzset, például NRRL B-3724, NRRL B-3725, NRRL B-3726, NRRL B-3727 vagy NRRL B-3728 jelzésű törzset szénhidrátot, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó steril táptalajon tenyésztünk. A fermentációt 30 C°-on végezzük, a 3 645 848 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban megadott módon. A fermentációt addig végezzük, míg a maximális izomeráz-aktivitást kapjuk, melyet standard mérési módszerekkel mérünk. A fermentáció ezen pontján a fermentleben szuszpendált nedves sejtek súlya általában a teljes fermentlé súlyának 4%-a. A fermentléhez valamely polivinil-imidazolint, például Primafloc C-7-et (kationos koagulálószer, Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania) adunk 2%-os vizes oldatként, melynek pH-értékét előzőleg 5,0 értékre állítottuk be. Az adagolt koagulálószer mennyisége a teljes fermentlé súlyának kb. 0,25%-a és az adagolást a fermentlé enyhe kavarása közben végezzük. A teljes sejt-aggregátumok képződése általában 10—15 perc alatt teljesen lejátszódik. Ezután a kavarást leállítjuk, mikor is a koagulált sejttömeg a fermentor aljára ülepszik. A sejteket a tiszta felülúszó legnagyobb részének dekantálásával, majd a nedves koagulátum vákuumszűrésével választjuk el. Az elválasztott teljes sejt-aggregátumokat fagyasztjuk és —5 C° hőmérsékleten tartjuk kb. 8 órán át a töltött oszlop készítése előtt, melynek elkészítésére az anyagot felengedett formában használjuk. A töltött oszlop készítéséhez az anyagot vízben szuszpendáljuk, és mechanikusan összetörve egységesebb részecskeméretet biztosítunk. Erre a célra egy Waring-keverő alkalmas, azzal a feltétellel, hogy a keverés igen rövid ideig tart. A szuszpenziót vízzel részben töltött oszlopba töltjük, mikor is a sejtek kiülepszenek. A töltött oszlopon ezután 50%-ig terjedhető koncentrációjú, megfelelő mennyiségű Mg++ -iont tartalmazó glükóz-oldatot vezetünk keresztül, melynek pH-ját 6 és 10 közé állítottuk be. Az oszlopot előnyösen 50—75 C° hőmérsékletre -melegítjük, izomerizáció fokának (glükózból fruktóz) növelésére, és a szennyező mikroorganizmusok növekedésének meggátlására. Az elfolyó oldat áramlási sebességét úgy szabályozzuk, hogy a glükóznak fruktózzá történő konverziója 40—45% legyen. A fenti eljárással elérhető glükóz-fruktóz konverzió foka 50% fölé is 5 emelhető, az izomerizáció hőmérsékletétől függően. Kívánt esetben két vagy több egymással sorba kapcsolt oszlop is alkalmazható, és a sejttöltet az oszlopokból kivehető további, glükóz izomerizációra történő használat céljából. Az izomeráz-10 -aktivitás megmarad, még a sejttömeg oszlopból történő kivétele, fagyasztása és szárítása után is, mely után az anyag ismételten felhasználható. A glükóznak fruktózzá történő izomerizációja 15 különböző Streptomyces-törzsekkel is végezhető, melyeket előzőleg koaguláltunk. Erre a célra alkalmas például az S. albus, S. echinatur, S. achromogenes, S. phaeochromogenes, S. flavovirens és S. olivaceus. A különböző Streptomyces tör-20 zsekből származó teljes sejtek vagy sejtmentes enzimkészítmények koagulálása az Arthrobacter-törzseknél megadott módon végezhető, és hasonló módon végezhetjük az izomerizációt is. 25 A következő példákban a találmány szerinti eljárást részletesebben ismertetjük. 1. példa 30 Arhtrobacter NRRL B-3728 törzset 3% dextrózt, 3% hús-proteint, 0,1% élesztőextraktumot, 0,6% ammóniumhidrogénfoszfátot, 0,2% káliumdihidrogénfoszfátot és 0,01% magnéziumszulfát-35 -hidrátot tartalmazó steril táptalajba oltunk. A kapott táptalaj pH-ját 6,9 értékre állítjuk be. A fermentációt 60 órán át 28 C°-on végezzük, mely idő elteltével a fermentlé pH-értéke kb. 5,5. A kapott fermentléhez 2 s/tf%-os Primafloc C-7 40 (ammóniumcsoportot tartalmazó polielektrolit) oldatot adunk oly módon, hogy a végső polielektrolit-koncentráció 0,25% legyen. A polielektrolit-oldat pH-értékét a hozzáadás előtt kb. 5 értékre állítjuk be, és az adagolás közben a fermentlevet lassan 45 keverjük. Kívánt esetben szűrősegédanyagot, például Celite 545-öt (szilíciumdioxid alapú) (Johns-Manville, Baltimore, Maryland) adunk a fermentléhez, 0,5 s/tf% mennyiségben, még a polielektrolit hozzáadása előtt. A polielektrolitot tar-50 talmazó fermentlé gyenge kavarását addig folytatjuk, míg stabil sejt-aggregátumok nem képződnek. (Kb. 10 percig.) A kavarást ezután abbahagyjuk, és a sejt-koagulátumokat hagyjuk kiülepedni. A tiszta felülúszó nagy részét dekantáljuk az 55 anyagról, majd ezt vákuumszűréssel gyűjtjük össze. Az elávasztott sejtanyagot vagy —5 C°-ra fagyasztjuk, vagy 55 C°-on szárítjuk, használat előtt. Az elválasztott aggregátumok összes izomeráz-aktivitása gyakorlatilag megegyezik a kezelés előtt a ferment-60 lében levő sejtek összaktivitásával, standard mérési módszerekkel történő vizsgálat alapján. Ezenkívül az elválasztott fermentlé-felülúszó vizsgálata nem mutat izomeráz-aktivitást, amely azt jelzi, hogy az izomeráz-aktivitást teljes egészében kinyertük a 65 koagulációs eljárással. 3
