167317. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rifamicin SV-származékok előállítására
5 167317 6 1. Vírus-izolálás és virál-polimeráz tisztítása A vírust egér sarcoma vírus által transzformált patkány-sejtekből (78 Al sejtek) és egér sarcoma vírus (Harvey szerint izolált) által transzformált egér-sejtekből (MEH sejtek) izoláljuk és tisztítjuk a fentiek szerint (Green és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei, USA, 67, 358-393, 1970, Rokutanda és munkatársai, Nature, 227 1026-1028, 1970). A vírus eredetű polimerázt 20—40-szer tisztítjuk a következőképpen: a tisztított vírust 0,5% NP—40 (nonidet P-40), 0,1 M NaCl, 0,01 N Trisz puffer (pH 7,4) és 0,001 M EDTA elegyével 5 percig szobahőfokon inkubáljuk és 15—30%-os szacharóz gradiensben zónálisan centrifugáljuk 10 mM nátriumfoszfát-pufferben (pH 7,4), 2,5 mM MgCl2, 10 mM ditiotreit és 5% glicerin jelenlétében 24 órán keresztül 38 000 fordulat/perc fordulatszámmal Spinco SW 41 típusú motorral. Az összegyűjtött 22 frakcióból az enzim-aktivitást mutató (13—17) csúcsfrakciókat egyesítjük és —70C°-on tároljuk 30%-os glicerinben. DNS-polimeráz-vizsgálat Az enzimet 1 órán keresztül 37 C°-on inkubáljuk reakcióelegyben, melynek összetétele a következő: 40 mM Trisz-puffer (pH 8,0), 5 mM ditiotreit, 30 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2 , 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP és lOjuCi 3 H-dTTP (12-18 Ci/mM), Green és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 385-393, 1970 szerint. A reakciót lSOjul IN perklórsav hozzáadásával fejezzük be. Vivőanyagként borjú-thymus-DNS-t adunk, a radioaktív • DNS terméket a fenti két irodalmi adat szerint állítjuk elő. Az endogén RNS-dependens DNS-polimeráz-aktivitást oly módon mérjük a kísérlet során, hogy a tisztított vírushoz előzetesen 0,01% NP-40-t adunk. A tisztított vírus eredetű polimeráz DNS-polimeráz-aktivitást 2 Mg poli d(A-T), mint templát jelenlétében, NP-40 nélkül mérjük. A rifamicin-származékok inhibitor hatásának vizsgálata: A rifamicin-származékokat dimetilszulfoxidban (DMSO) oldjuk 5 mg/ml koncentrációban és 4 C°-on tároljuk. Az endogén RNS-dependens DNS-polimeráz-aktivitás gátlást úgy mérjük, hogy 2jul rifamicin-származék fenti koncentrációjú dimetilszulfoxidos oldatát vagy 2/LJ dimetilszulfoxidot (kontroll) adunk a kísérleti keverékhez, melyhez előzetesen 15—30jug vírus-eredetű proteintartalmú roncsolt vírust adtunk. Az enzim-inkubációt 37 C°-on 60 percig végezzük. A tisztított enzim-gátlást úgy ellenőrizzük, hogy a rifamicin-származék 2 IÁ DMSO-os oldatát vagy a tiszta DMSO-t 30 M1 enzimmel (1-2 jug protein) 10 percig 37 C°-on előinkubáljuk, ezután 70 jul szubsztrát keveréket adunk hozzá és a fentiek szerint járunk el tovább. A fenti kísérletekben a találmány tárgya szerinti előállított vegyületek 2-100 jug/ml koncentrációban, vagy kisebb koncentrációban a H3 -dTTP beépülést a kontroll tesztekhez képest kevesebb, mint 10%-ra csökkentik. Ez világosan mutatja az 5 RNS-tumor-vírusok carcinogenezis mechanizmusának gátlását, mely összhangban van a legtöbb jelenlegi biokémiai elgondolással.TM A reverz transzkriptáz hatás gátlását az egér 10 leukémiai vírus polimerázzal való vizsgálatok is bizonyítják. Az egér leukémia vírus RNS-dependens DNS-polimerázt Triton X 100-zal feltárt virionokból állítjuk elő Gallo és munkatársai szerint [Nature, New Biology, 232, 141 (1971)]. 15 A „Rauscher és Moloney típusú" vírusokat előzetesen a következőképpen tisztítjuk: kis sebességű centrifugálással a sejttörmeléket eltávolítjuk és 60%—20%-os szacharózzal fedjük, majd 1,16 g/ml szacharóz sűrűségi gradiens tartományban kötjük. 20 A preparált vírus végső koncentrációja 101 ' részecske/ml volt. Templátként 70S RNS-t használunk. Az enzimgátlás szempontjából 50 Mg/ml, vagy annál kisebb koncentrációt találtunk hatékonynak. 25 Hasonló eredményeket kapunk a humán szervezet tumorsejtjeinek polimerázai használata esetén is. Ezen esetben a gátló hatást normál sejt polimerázokon is tanulmányoztuk, ez szelektív hatást mutat. Az(I) -általános képletű rifamicin-30 -származékok a két tisztított DNS-polimerázra, melyeket (1) humán normál (PHA stimulált) vér lymphocitákból, (2) lymphoblast sejt vonalból (normál donortól), (3) humán leukémiás vér lymphoblastból izoláltuk, gyakorolt hatás miatt 35 jelentősek. A kísérletekhez szintetikus és/vagy natív templátokat használtunk. A kísérleti eljárások jellemző példái a követ-40 kezők: Humán vér limphoblastok A leukémiás limphoblastokat akut limphoid 45 leukémiás (ALL) páciensek perifériás véréből leukoforézissel izoláltuk. A sejteket kimostuk és az erythrocitákat hipotóniás elválasztással távolítottuk el. 50 Anormal limphocitákat egészséges donorok perifériális véréből nyertük, a granulocitákat nylon-gél-oszlopon történő kromatográfiával távolítottuk el. A limphocitákat phytohaemagglutininnel (PHA) 72 órán keresztül stimuláltuk (Gallo és 55 munkatársai, Science, 165, 400, 1968) a DNS-polimeráz-aktivitás növelése céljából. Mindazonáltal az anyagellátási problémák miatt megfelelő mennyiségű sejt előállításához humán „normál" szövettenyészet sejt vonalát (1788) használtuk fel a 50 kevéssé tisztított DNS-polimeráz kiegészítésére a kezdeti tanulmányok összefoglalására. Az érdekes vegyületeket azután részletesebben vizsgáltuk normál és leukémiás vér limfocitákból előállított magasabb tisztasági fokú enzimeken. Ezeket a 65 szövettenyészet sejteket az Associated Biomedic Systems, Inc-től szereztük be. 3
