167317. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rifamicin SV-származékok előállítására

167317 DNS-polimeráz előállítások A celluláris DNS polimerázt normál vér (PHA stimulált) limfocitákból, leukémiás vér limfocitákból és (1788) limfoid sejtekből extraháljuk és izoláljuk hipotóniás pufferrel homogenizálva, majd az extralizoszómás törmelékből Triton X 100-zal és/vagy magas koncentrációjú sóval való extrakcióval. Differenciál centrifugálás után a sejt-extraktumokat DEAE cellulózon, foszfocellulózon és Sephadex G200 oszlopon történő kromatografálással tisztítjuk. Kísérletek DNS-polimerázzal A DNS-polimeráz kísérleteket 100/ul végtérfogatban végezzük. A kísérleti elegy összetétele a következő: Trisz-HCl-puffer, pH 8,3, 50 mM, MgAc 6,0 mM, ditiotreit, 8,0 mM, NaCl, 6,0 mM. A pH beállítása az inhibitor, melyet előzetesen DMSO-ban oldunk, hozzáadása után történik. ADMSO végkoncentrációja 0,5% és minden kontrollminta ezt a mennyiségű DMSOt tartalmazza. A kísérletekben olyan enzimkoncentrációt használunk, amely az inkorporációt kb. 1,0 mólonként/óra mértékben katalizálja. Az enzimet a legtöbb esetben 5 percig az inhibitorral előinkubáljuk. A reakciót ezután vagy szintetikus DNS/poli d(AT), Mües Lab. (és DNS.RMS hibrid/oligo dT.poli rA) templáttal 5 Mg/ml koncentrációban, vagy natív templátokkal iniciáljuk, lazac-sperma DNS-el, 50jUg/ml koncentrációban és 70S virál RNS-sel aktiválva, 10 ;uCi (3H-metil)-TTP-t, New England Nuclear gyártmányú, 18,6 mCi/|umol-os készítményt liofilizálva és 0,01 M HCl-ban oldva megfelelő minőségű (és dATP/8- 10"5 M, szintetikus templáttal), vagy mind a három dezoxiribonukleozid-trifoszfátot (8* KT

5 M RNS-sel vagy DNS-sel templált reakciók) használunk. Egyes kísérletekben az enzimet nem inkubáltuk elő az inhibitorral. Ezen esetekben a reakciókat úgy iniciáltuk, hogy az enzimet az inhibitort tartalmazó reakcióelegyhez adtuk. A kísérleteket az inkubáció kezdetekor és 30 perc múlva 2 ml 0,08 M-os nátriumpirofoszfáttal állítottuk le és fejeztük be és 12,5%-os hideg triklórecetsavban (TCA) oldott élesztő RNS-sel (400 Mg), mint vivőanyaggal csaptuk ki. A termékeket Millipore típusú szűrőn szűrtük, jól kimostuk 5%-os TCA-cal és 1 ml DMSO-etanol-0,1 M-os NaCl (0,5 : 70 : 29,5 arányú) keverékével, szárítottuk és 2 ml BBS3 (Beckman) és 10 ml folyékony fluor (New England Nuclear) keverékében Packard szcintillációs számolóban számláltuk A koncentrációt 5-20 7/ml között változtatva 50%-os leukémiás polimeráz-inhibiciót idéztünk elő szintetikus DNS-templáttal. A szintetikus RNS-templáttal (poli rA.rU) közvetlenül végrehajtott reakciók még érzékenyebbek voltak. A natív templáttal normák vagy tumor-sejt-polimerázzal végzett kísérletekben a tumor-enzimek magasabb érzékenységet mutattak a vizsgált vegyületekkel szemben. Az új rifamicin-származékoknak más biológiai sajátságai vannak, ugyanis a Moloney és Kirsten féle egér sarcoma vírus-változat által fertőzött egér-, patkány- és humán-s^tek esetén fókusz-kép-5 ződés-gátlást hoz létre, szelektív inhibiciót hoz létre a vírus tevékenységében a már transzformált egér- és humán-sejteknél, az egér sarcoma vírus által transzformát nem-termelő egér- és patkány-sejt-rendszereket használva a normál állapotba 10 visszatérő sejtek észlelését teszi lehetővé. Jelen találmány tárgya szerint előállított vegyületek ezenkívül megőrizték szelektív toxicitásukat a vírus által transzformált egér-, patkány- és humán-szervezet sejtjeinek esetében, ha a telepképző 15 képességet vizsgáljuk. A vegyületek gátló hatásának meghatározása céljából a Moloney sarcoma vírus BALB/3T3 szövetkultúrákon való fókuszképzésére a vizsgálato-20 kat a következőképpen végeztük: BALB/3T3 sejtkultúrát 250 ml-es műanyag edényekben 10% magzati szarvasmarha-szérumot és Eagle-féle minimál táptalajon növesztünk. A sejt-25 számlálást Coulter számlálóban végezzük oly módon, hogy a sejteket előzőleg tripszin-EDTA-elegyben szuszpendáljuk és a növesztő közeggel hígítjuk. A Moloney sarcoma vírust tumor-homogenizátum formájában használjuk és négyszer átoltjuk 30 egy nagyhozamú svájci törzsből származó egér-embrió-sejt-vonalba (cell line) és a BALB/3T3 sejtek fókuszképző képességét vizsgáljuk. A ki serietekben továbbá a Hartley és Rowe [Proc. Nat. Acad. Sei., 55, 780 (1966)] szerinti módosított eljárást 35 alkalmaztuk. Jelen munkában az edényeket 1—2 -106

sejtet tartalmazó 25 ml táptalajjal töltjük meg, és 37 C°-on 24 órán keresztül inkubáljuk. A folyadék eltávolítása és a fókuszképző képesség meghatározása után a vírust 0,5 ml 40 táptalajhoz adjuk és 90 percig 37 C°-on egyrétegű sejtekre adszorbeáljuk. Ezután az abszorpciós periódus után előre meghatározott mennyiségű, kb. 5-10 Mg/ml rifamicin-vegyületet tartalmazó oldatot (a rifamicin-vegyületből 1 mg/ml koncentrációjú 45 dimetilszulfoxidos oldatot készítünk) és 25 ml táptalajt adunk a tenyészethez és visszahelyezzük az inkubátorba. Kontrollként csak dimetilszulfoxidot és táptalajt adunk egy szeparált kultúrához. 3 napos inkubáció után a kultúrákban folyadékot 50 cserélünk, és a transzformált sejtek fókuszait 7 napon keresztül leszámoljuk. Ugyanezen módszerrel tanulmányozzuk a New Jersey szerotípushoz tartozó vesicular stomatitis 55 vírust is. A vírus növelését és a kísérleti módszereket, amelyeket alkalmaztunk, Hackey és munkatársai, Virology, 31, 114 (1967) írták le. Ezen sajátságok lehetővé teszik, hogy ezen 60 vegyületek jelentős inhibitor-aktivitást fejtsenek ki, vírus által létrehozott tumorokon az állati szervezetben. A találmány tárgyát képező eljárással néhány jellemző vegyület előállítását és gyártását a 65 következő példák mutatják. 4