167276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-27106 jelű metabolit előállítására

167276 7 8 ferde-agaron, agar-lemezen vagy rázott tenyészetben növesztjük az organizmust. A nagyobb térfogatú tenyésztést süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, nagy fermentorokban végezzük. A sterilezett táptalajt a fermentáció elindítására spóraszuszpenzióval is olthatjuk. Mivel azonban a spóraszuszpenzióval való oltást hosszabb növekedési lagfázis követi, előnyösen vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokulum előállítására kismennyiségű táptalajt oltunk a mikroorganizmus spóráival vagy micéliumaival, így tenyésztés után friss, gyorsan növekvő tenyészetet kapunk. A vegeinokulummal ezután nagytérfogatú fermentorban sterilezett táptalajt oltunk. Vegetatív inokulumtáptalajként használhatunk a főfermentációs táptalajjal azonos és más összetételű táptalajt is. A Streptomyces candidus NRRL 5449 törzs 26 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten növekszik. A növekedés és a spórázás optimális hőmérséklete azonban 32—37 °C. Mint ahogy ez a süllyesztett, levegőztetett fermentációk esetén szokásos, a táptalajon a tenyésztés alatt steril levegőt buborékoltatunk át. Az organizmus legjobb növekedése és a maximális A 27106-termelés érdekében a fermentációs táptalajon annak térfogategységére számítva percenként 0,1 térfogategységnél több levegőt buborékoltatunk át. A legjobb termelés abban az esetben mérhető, ha percenként a fermentációs táptalaj térfogatának 1/3—Y2 részének megfelelő mennyiségű levegőt engedünk át a tenyészeten. A monensin A 27106 metabolittá való átalakításához szükséges fermentációs idő változik. A monensin A 27106 vegyületté való átalakításához megfelelő mennyiségű glükózt kell a táptalajhoz adnunk. Általában, ha a glükóz adott mennyiségben jelen van a táptalajban, továbbá a monensin mennyisége 0,1—1,0 g/liter táptalaj, a monensin átalakulása A 27106 metabolittá a 36. és 72. óra között gyakorlatilag teljes. A legjobb átalakítást abban az esetben érjük el, ha a táptalaj literenként 0,5 g és 0,7 g közötti mennyiségű monensint tartalmaz. A táptatalajba előnyösen 2,0% és 2,5% közötti mennyiségű glükózt adagolunk. A fermentáció alatt a táptalaj glükóztartalmát ,,papír-teszt"-módszerrel mérjük. Akkor, ha a glükóz koncentrációja 2%-nál kisebb értékre csökken, az előnyös szint fenntartására glükózt adagolunk. Abban az esetben, ha a Streptomyces candidus enzimrendszerét használjuk a monensin A 27106-tá alakítására, az enzimet nem szükséges többször tisztítanunk. A szűrt tenyészlevet például liofilezzük és legalább két hétig tárolhatjuk, mielőtt az eredeti térfogat 1/6- részének megfelelő mennyiségű vizes pufferban újra oldjuk. A legmagasabb konverziófokot ebben az esetben akkor érjük el, ha 2,5 g liofilezett készítményhez 25 mg monensint adunk, és 72 órán át hagyjuk folyni az enzimreakciót. A hatékony enzimrendszer mind a szűrt tenyészlében, mind a sejtekben jelen van. Tisztább enzimkészítményt kapunk, ha a sejtekből indulunk ki. A sejteket fagyaszthatjuk és legalább három hónapon át tárolhatjuk. A felolvasztott készítményt vizes pufferban szuszpendáljuk, a sejteket ultrahanggal feltárjuk és centrifugáljuk a szuszpenziót. A tisztított sejtüledéket elkülönítjük és pufferban szuszpendáljuk, majd dializáljuk. Ilyen módon, a 5 tenyészléből elkülönített, 200 g súlyú sejttömegből készített dializátummal, glükózból és 25 mg monensinből A 27106 metabolitot kapunk. Az átalakítást vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. A monens sinzilikagélen (F 2 54, E-N Labo-10 ratories, Inc., Elmsford, N. Y.), benzol és metanol 7:3 arányú elegyével vizsgált R^-értéke 0,62, míg az A 27106 jelű metabolite 0,49. Az előhívást vanillin-reagenssel foganatosítjuk. A reagens előállítására 100 ml vízmentes e an. iban 3 g vanillint 15 oldunk, majd az oldathoz 2 ml tömény kénsavat adunk. Az A 27106 metabolit mind a szűrt tenyészlében, mind a micéliurnban jelen van. Ennek megfelelően az A 27106 jelű vegyület elkülönítésére kidolgozott 20 eljárások lehetővé teszik a termék izolálását mindkét helyről. így, például úgy járunk el, hogy szűrjük a tenyészlevet, és az A 27106 elkülönítésére mind a szürletet, mind a micéliumos szűrési maradékot megfelelő oldószerekkel extraháljuk. Az 25 extraktumokból ismert eljárások segítségével különítjük el a terméket. Az A 27106 metabolit adagolására a tenyészetnek a táptalaj alkatrészeket és a micéliumokat is tartalmazó szilárd halmazállapotú részét extrakciós, vagy 30 más elkülönítési eljárások alkalmazása nélkül is használhatjuk, előnyösen azonban úgy járunk el, hogy a vizet eltávolítjuk a micéliumből és a táptalajból. A tenyészetet például fagyasztva szárítjuk, a készítményt pedig összekeverjük a takar-35 mánnyal. Úgy is eljárhatunk, hogy a szilárd halmazállapotú fermentációs termékeket a víz részleges eltávolításával híg szuszpenzióvá alakítjuk, amelyet azután hasonló halmazállapotú takarmányokkal keverünk. 40 Az egyik lehetséges extrakciós elkülönítés szerint úgy járunk el, hogy a leállási tenyészlevet szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük. A szűrési maradékot poláris oldószerrel, például metanollal extraháljuk. A metanolos extraktumot töményítjük, majd 45 a sűrítményt hozzáadjuk az eredeti vizes szűrlethez. Az egyesített oldatot ezután fél-fél térfogat kloroformmal extraháljuk. Csökkentett nyomáson, desztillációval eltávolítjuk az oldószert, amikor sötét borostyánkőszínű olajos desztillációs maradékot ka-50 punk. Az olajos anyagot színtelenítés céljából aktív csontszénből kevert kromatografáló oszlopra öntjük, és eluálást kloroformmal végezzük, és egy gramm olajos anyagra számítva 20 g aktív szenet 55 használunk. Csökkentett nyomáson desztilláljuk az eluátumot, amikor desztillációs maradékként halványsárga-színtelen olajos terméket kapunk. Ezt a lehető legkevesebb kloroformban oldjuk, az oldatot szilikagélből készült kromatografáló oszlopra önt-60 jük. Az eluálást etilacetáttal végezzük, az eluációt vékonyrétegkromatográfiával ellenőrizzük. Az etilacetáttal a szennyezőanyagok eluálódnak. Az eluálást etilacetát és metanol elegyével folytatva megkapjuk az A 27106 metabolitot. 65 Az A 27106 metabolit (nátriumsó) fehér színű 4