167273. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetoxi-cefalosporin C előállítására
167273 25 26 tesztorganizmust használva bioautográfiával hívjuk elő. A kromatográfiás eredmények jobb kiértékelhetősége érdekében a mérendő mintákat felcseppentés előtt penicillinázzal kezeljük. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük. 1. példa A Cephalosporium NRRL 5445, Cephalosporin chrysogenum ATCC 14 615, Emericellopsis NRKL 5446 és az Emericellopsis NRRL 5447 jelű törzsek spóráival külön-külön a következő összetételű ferdeagar-tenyészeteket oltjuk: Laktóz lg Glicerin 1 g Szója-pepton1 0,25 g Kukorica és malátakivonat2 0,25 g MgS04 .7H 2 0 0,05 g EeS04 -7H 2 0 0,001 g CaC03 0,2 g Nyomelem oldat3 0,625 ml Agar 2g Víz 100 ml 1 Enzimatikusan emésztett szójaliszt. 2 PRODULAC, National Distiller Products Co. 3 Összetétele a következő CuSO,.5H,0 FeSOy7H2 0 MnCl2 -4H 2 0 ZnSCy7H2 0 Víz 0,102 g 0,018 g 0,126 g 0,024 g 100 ml KH2 P0 4 K2 HP0 4 CaCl2 -2H 2 0 A tenyészeteket 26 °C hőmérsékleten 7 napon át inkubáljuk. Az érett tenyészetekből steril desztillált vízzel a szokásos módon spóraszuszpenziót készítünk. Az így kapott spóraszuszpenziók mindegyikével 2—2 steril, az alábbi összetételű táptalajt oltunk: Mogyoróliszt 2 g Malátakivonat 2 g Kukoricalekvár 0,5 g MgSCy7H2 0 0,025 g 0,1 g 0,05 g 0,01 g Nyomelemeket tartalmazó oldat1 0,625 ml Víz 100 ml 1 A nyomelemeket tartalmazó oldat a fentiekben megadott összetételű. A táptalajok pH-ját sterilezés előtt 6,5-re alítjuk be. A beoltott tenyészeteket 48 órán át, 26 °C hőmérsékleten olyan rézógépen tenyésztjük, amelynek kitérése 5 cm. A kinőtt tenyészetekkel ezután főfermentációs táptalajt oltunk; oltási térfogat 1%. A főfermentációs táptalaj a következő összetételű: Szacharóz 4 g Glicerin 1 g Nátriumglutamát 0,5 g Mogyoróliszt 2 g Ferriammóniumszulfát KNO, 0,3 g 2,0 g CaCO-3 0,3 g Víz 100 ml 5 A nagyobb térfogatú készülékekben végzett fermentációkkor előnyösen felületaktív anyagot vagy habzást gátló készítményt adunk a táptalajhoz. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 6,5-re állítjuk be. A beoltott főfermentációs tenyészetet 26 °C hő-10 mérsékleten, keverés közben 5 napon át tenyésztjük. A fermentáció teljes ideje alatt percenként a fermentációs táp talaj-térfogat felének megfelelő térfogatú steril levegőt buborékoltatunk át a tenyészeten. A táptalaj pH-ja a tenyésztés végén 7,5. 15 Mindegyik tenyészetből 15—15 liternyi fermentlevet elkülönítünk és pH-jukat kénsavval 2-re állítjuk be. A savas pH-jú tenyószleveket ezután egy órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd pH-jukat nátriumhidroxid oldattal 6,0-ra állítjuk be. 20 Szűrés után n-butanollal extraháljuk a szűrletet, amikor a szennyezőanyagok a szerves oldószeres extraktumban maradnak. A vizes fázist aktív szénből készült oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot desztillált vízzel mossuk. A vizes mosófolyadékot 25 kiontjuk. Az eluálást aceton és víz 1:1 arányú elegyével végezzük. Az eluátumot az aceton eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékként kapott vizes oldatot Amberlite IRA—68, kvaterner ammónium-polisztirol 30 acetátciklusos gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot először vízzel mossuk, a vizes eluátumot kiontjuk. A hatóanyagot 0,15 n vizes nátriumacetát oldattal eluáljuk az oszlopról. Több frakciót szedünk, és a dezacetoxi-cefalosporin 35 C-t tartalmazó frakciókat egyesítjük. A különböző organizmusokkal előállított tenyészléből kapott, dezacetoxi-cefalosporin C-t tartalmazó frakciókat bioautográfiával vizsgáljuk. A kromatografálást minden esetben nem előkezelt What-40 man No. 1. kromatografáló papíron, felülről lefelé futtatva végezzük. Az eluáló elegy acetonitril és víz 80:20 arányú elegye. A kromatografáló kád alsó részébe vékony rétegben 300 ml 37,5%-os n-propanolból, 25% piridinből, 7,5% ecetsavból és 30% 45 vízből készült elegy és 100 ml acetonitril elegyét öntjük. A deacetoxi-cefalosporin C elhelyezkedését a kromatografáló papíron bioatográfiával, Pseudomonas solanacearum tesztorganizmust használva állapítjuk meg. 50 A fenti kromatográfiás eljárás szerint dezacetoxicefalosporin C-t tartalmazó frakciókat egyesítjük. Az egyesített frakciókat aktív szénből készült kromatografáló oszlopon adszorbeáltatjuk, az oszlopot az oldódó szervetlen vegyületek, például a nátrium-55 acetát eltávolítására vízzel mossuk. Ezt követően víz és aceton 1:1 arányú elegyével eluáljuk a hatóanyagot. Az eluátumot csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor száraz desztillációs maradékként a dezacetoxi-cefalosporin C nyers nátriumsóját 60 kapjuk. A nyersterméket cellulózból (Avicel pH 101) készült oszlopon kromatografálva tovább tisztítjuk. Az antibiotikumot az oszlopról acetonitril és víz 80:20 arányú elegyével eluáljuk. Az eluáláskor több frakciót különítünk el, majd az előzőekben ismer-13
