167273. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetoxi-cefalosporin C előállítására

23 167273 24' vizes acetonnal eluáljuk az oszlopról. Az eluátumot desztilláljuk, a desztillációs maradékként kapott vizes oldatot bázikus anioncserélő gyantával készült oszlopon kromatografáljuk. Bázikus anioncserélő gyantaként kvaterner ammónium-polisztirol típusú gyantákat, például Dowex 1, Dowex 2 (Dow Chemical Co., Midland, Mich.) és IRA—400, IRA— 45, IRA—68 (Amberlite, Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.) anioncserélőket használhatunk. A gyanták hidroxil-, acetát-, formiátciklusban, vagy más ciklusban létezhetnek. A tömény, a szénoszlopról eluált és bepárolt oldatot az anioncserélő gyantával töltött kromatografáló oszlopra öntjük, és vízzel mossuk. A dezacetoxi-cefalosporin C-t sóként eluáljuk az oszlopról, az eluálást egy gyenge bázissal, például ha acetát-alakban létező oszloppal dolgozunk, úgy nátriumacetáttal/végezzük. A nátriumacetátot 1 n vagy hígabb vizes oldatként használjuk. A nátriumacetát oldat koncentrációja nem lényeges, de a szervetlen só (nátriumacetát) túlzottan nagy mennyiségének jelenléte az eluátumban nem előnyös, így az eluálást 0,1 n és 0,5 n közötti koncentrációjú, előnyösen 0,15 n töménységű oldattal végezzük. Ha az anioncserélő gyantát formiát- vagy más előnyös alakban használjuk, eluáló oldatként az ennek megfelelő só vizes oldatát használjuk, így, ha a gyanta formiát-alakban van, úgy ammóniumformiáttal ehiálunk. Az eluáláskor több frakciót különítünk el, és a frakciók dezacetoxicefalosporin C-tartalmát bioautográfiával meghatározzuk. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük. Az egyesített eluátumot a szervetlen sók, például a nátriumacetát (amely az előző eluáláskor került a termékbe) eltávolítására aktivált szénből készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot a sók eltávolítására vízzel mossuk, a dezacetoxicefalosporin C-t pedig 50%-os vizes acetonnal eluáljuk az oszlopról. Az eluátumot desztilláljuk, amikor a desztillációtól függően vagy száraz desztillációs maradékot, vagy vizes sűrítményt kapunk. Ez utóbbit liofilizáljuk, amikor mindkét esetben, nyers, szilárd halmazállapotú termékként deacetoxi-cefalosporin C-t kapunk. A dezacetoxi-cefalosporin C nyersterméket cellulóz vagy szilikagél kromatografáló oszlopon, vagy más nem ionos természetű adszorbensen tovább tisztítjuk. A dezacetoxi-cefalosporin C-t ezúttal acetonitril és víz 80:20 arányú elegyével eluáljuk az oszlopról, miközben több frakciót különítünk el. A frakciók dezacetoxi-cefalosporin C-tartalmát papírkromatográfiás vagy bioautográfiás úton, Pseudomonas solanacearcum tesztorganizmust használva határozzuk meg. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük és desztillációval szárazra vagy kis térfogatú folyékony halmazállapotú desztillációs maradékig pároljuk. A tömény vizes oldatot, vagy a száraz desztillációs maradékot a lehető legkisebb mennyiségű izo-propilalkoholban oldjuk, az alkoholos oldatot pedig fölös mennyiségű dietilóterbe öntjük. A tiszta dezacetoxi-cefalosporin C-t az anioncserélő gyanta eluálására használt, sót tartalmazó vizes oldatban jelenlévő kationnal alkotott vegyületként kapjuk meg. Például, ha eluálásra a nátriumacetát vizes oldatát használtuk, úgy a dezacetoxi-cefalosporin C-t mononátriumsójaként kapjuk meg. A deacetoxi-cefalosporin C sóját szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. A dezacetoxi-cefalosporin C-t a találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint a kö-5 vetkezőképpen különítjük el. A teljes tenyészlé pH-ját kénsavval 2-re állítjuk be, majd egy órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután nátriumhidroxiddal 6,0-ra állítjuk be a tenyészlé pH-ját és a micélium, továbbá az oldhatatlan anyagok el-10 távolítására, szűrési segédanyag adagolása után szűrjük. A vizes szűrletet ezután további szennyezőanyagok eltávolítására n-butanollal extraháljuk, majd a kiextrahált levet aktív szénből készült oszlopon kromatografáljuk. 15 Az oszlopot vízzel mossuk, a fermentációs terméket 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az eluátumot az aceton eltávolítására desztilláljuk, a vizes desztillációs maradékot acetátciklusú kvaterner ammónium-polisztirol gyantán (Amberlite IRA—68; 20 Rohm és Hass, Philadelphia, Pa.) kromatografáljuk. Az oszlopot először vízzel, majd a dezacetoxi-cefalosporin C-t és a többi fermentációs terméket 0,15 n vizes nátriumacetát oldattal eluáljuk. Az aktív anyagot tartalmazó eluátumokat egyesítjük és ak-25 tív szénen adszorbeáljuk. Az oszlopot az ioncserélő gyanta eluálásakor a termékbe került nátriumacetát és más sók eltávolítására vízzel mossuk. A deacetoxi-cefalosporin C-t víz és aceton 1:1 arányú elegyével eluáljuk. Az eluátumot desztilláljuk, ami-30 kor száraz desztillációs maradékként a nyers dezacetoxi-cefalosporin C nátriumsóját kapjuk. A nyersterméket cellulózból (Avicel pH 101) készült kromatografáló oszlopon tisztítjuk. Az eluálást acetonitril és víz 80:20 arányú elegyével vé-35 gezzük és több frakciót különítünk el. A dezacetoxi-cefalosporin C-t tartalmazó frakciókat (a hatóanyagtartalmat bioautográfiával határozzuk meg) egyesítjük és csökkentett nyomáson desztilláljuk, amikor száraz desztillációs maradékot kapunk. 40 A száraz, szilárd halmazállapotú terméket, a dezacetoxi-cefalosporin C-t a lehető legkisebb mennyiségű izo-propilalkoholban oldjuk. Az alkoholos oldatot dietiléterbe öntjük, amikor a dezacetoxicefalosporin C mononátriumsója kiválik az oldatból. 45 A dezacetoxi-cefalosporin C elkülönítésére a találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint úgy is eljárhatunk, hogy az acetátciklusban lévő anioncserélőről eluált oldatot bepároljuk, és 20%-os vizes nátriumacetát ol-50 datot adunk a sűrítményhez. Ezután hűtés közben keverjük az oldatot, amikor a dezacetoxi-cefalosporin C mononátriumsója kiválik az oldatból. A dezacetoxi-cefalosporin C sóját ismert módszerekkel szabad savvá alakíthatjuk. A sóalakban 55 lévő vegyületet például kationcserélő gyantával töltött oszlopon átengedve szabad savat kapunk. A nyers tenyészlé és a gyantaeluátumok dezacetoxi-cefalosporin C-tartalmának meghatározására Whatman No. 1. kromatografáló papírt haszná-60 lünk, és a futtatást felülről lefelé végezzük. Futtatóelegyként acetonitril és víz 80:20 arányú elegyét használjuk, a légteret pedig n-propanol, piridin, ecetsav, acetonitril és víz 45:30:9:40:36 elegyét használva telítjük. 65 A kromatogramokat Pseudomonas solanacearum 12