167243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás redukált B12 vitamin (B12r), hidroxokobalamin, valamint alkilkobalaminok és sóik előállítására

167243 11 12 min-szulfát, mely • hatóanyagban 39,3 g-nak felel meg, melléktermékként 1,8 g B12

vitamint kapunk. Kitermelés 96,9%. 6. A 2. példa szerint járunk el. Az elució során kapott főfrakciót egy 10 cm belső átmérőjű, 1000 ml térfogatú, OH-formájú DEAE ioncserélő cellulóz oszlopon engedjük át, 1 m/óra lineáris sebesség: alkalmazásával. A kapott termék 40,5 g 12% nedvességtartalmú hidroxokobalamin-bázis, mely hatóanyagként 35,6 g-nak felel meg. A kristályosítási anyalúgot és kromatografálási frakciókat elegyítés után B12

vitamin termékre feldolgozzuk és 4,0 g B12

vitamint kapunk. Kitermelés 93,2%. 7. 1,0 g B12

koenzim kristályt metanolban oldunk; az oldat koncentrációja 100 mg/l, térfogata 10 1. Oxigénmentes nitrogéngázzal oxigénmentesítjük az oldatot, majd zárt rendszerben az ugyancsak N2 gázzal átöblített fotolizátor készüléken engedjük át, átfolyatási sebesség: 1 l/perc. A készülék azonos az 1. példában leírttal. A megvilágítás távolsága 30 cm. A fotolizátorból kilépő oldatot az alkilező reaktorba vezetjük, ahol ugyancsak N2

áramban, fénytől védve 10 ml metiljodid 10%-os metanolos oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten kevertetjük; körülbelül 10—12 óra állás után a reakcióelegy színe pirosra válik. Ezután (abszolút aceton hozzáadással a terméket közvetlenül is kristályosíthatjuk) vákuumban maximum 30 °C-on bepárlást eszközlünk a térfogat körülbelül 1/20 részére és így az 500 ml koncentrátumot abszolút aceton adagolással kristályosítjuk. A kapott termék súlya: 0,28 g metilkobalamin. Kitermelés: 32,8% (B12r

-re vonatkoztatva). 8. Propionibacterium shermanii-t (deponálási szám: 630.903/24 OKI) 4% glukózt és 2% kukoricalekvárt, 3% ammóniumszulfátot, nyomelemeket és bioszanyagokat tartalmazó táptalajon tenyésztünk anaerob viszonyok között; a fermentálást 30 °C-os hőmérsékleten hajtjuk végre. 8 óránként semlegesítünk 20%-os nátriumkarbonát oldattal, majd a sejttenyészet növekedésének utolsó szakaszában, mintegy 40 órás fermentálás után 5,6-dimetilbenzimidazol prekurzort adagolunk. A fermentáció idejét a szénhidráttartalom csökkentése és a prekurzor beépülése szabja meg, ez körülbelül 48 óra. A baktériumsejteket a fermentléből szűréssel kinyerjük. E biomasszából vízzel körülbelül 10 g/100 ml szárazanyagtartalmú szuszpenziót készítünk. A sejtszuszpenziót 100 °C-on 5 másodperces hőexpozícióval fény kizárása mellett feltárjuk. A feltárás után az elegyet 20—30 °C-ra hűtjük. Erőteljes kevertetés közben kémhatását 1 n sósavval pH 4-re állítjuk és további 15 percig kevertetjük, majd 1 n nátriumhidroxiddal 1 pH/30 perc sebességgel pH 5 értékre állítjuk. A sejtmasszát ezután kiszűrjük és a hatóanyagtartalmat kimossuk. A kapott oldatot Wofatit EZ gyantán kromatografáljuk (megkötjük). Az eluátumot, mely 900 1 50%-os vizes acetonban oldott 708 g korrinoid-koenzim tartalommal bír, összetétele 10 15 20 25 30 35 40 súly alapján megfelel 289 g hidroxokobalaminnak), 260 nm és 550 nm hullámhosszúságú fénnyel együttesen fotolizálunk. Az oldatot 4 mm-es rétegben sugározzuk be fényforrásként megfelelő szűrővel ellátott 4 db 1000 W égőt és 1 db PRK 2 típusú UV fénycsövet (375 W) együttesen alkalmazva. A fotolízis közben levegőt áramoltatunk át a rendszeren. A fotolízist folyamatosan végezzük 10 l/perc átfolyási sebesség alkalmazásával. A fotolizált oldatot vákuumban 35 °C-on oldószermentesítjük, így 206 1 vizes oldatot kapunk. A CM-cellulózon való eluciós kromatográfiát 11 cm belső átmérőjű, 2000 ml ioncserélő cellulózt tartalmazó oszlop segítségével vitelezzük ki. A megkötés sebessége: 1,25 m/óra. Az elucióra ammóniumacetát különböző normalitású oldatait használjuk. Az egyes frakciók: Térfogat Koncent-HatóJelzés Eluens fogat ráció anyag (1) (mg/l) (g) előfrakció 1. 10-3

n ammónium10,0 25 0,25 előfrakció 2.. acetát 12,0 408 4,9 főfrakció 5.10-3

n 31,5 8820 278 ammóniumacetát utófrakció 10-2

n ammónium-5% B12

koenzim és 4% kísérő korrínoidkoenzim faktor, megfelezzük. a) 450 1 vizes acetonos eluátomot, pH = 5,6, mely 339,5 g B12

koenzimet tartalmaz (ez molekulaacetát A főfrakciót abszolút aceton hozzáadásával kristályosítjuk. A kivált kristályokat leszűrjük, mérjük. 288 g 12%-os nedvességtartalmú hidroxokobalamin-acetát kristályt kapunk, mely hatóanyagban 243 g-nak felel meg. A kristályosítási anyalúgot, mely 31,2 g hatóanyagot tartalmaz, oldószermentesítjük, majd egyesítjük az előfrakció 2.-vel és nátriumcianid adagolással a hatóanyagtartalmat B12

vitaminná alakítjuk át. 45 Az oldatból a B12

vitamint izoláljuk; összesen 31,5 g B1?

vitamint kapunk. Az összesített termékre (243 + 31,5 = 274,5 g) számított kitermelés 95,1%. b. 450 1 vizes acetonos eluátumot (pH 4,8) vákuumban 35 C°-on oldószermentesítünk, így 180 1 50 vizes oldatot kapunk, mely 335 g B12

koenzimet tartalmaz; ez molekulasúly alapján 284,5 g hidroxokobalaminnak felel meg. A vizes B12

koenzim oldatot az a) pontban leírtak szerint fotolizáljuk, az átfolyási sebességet 3 l/perc értéken tartva. 55 A fotolizáit oldat kromatografálása menete azonnos az a) pontban leírtakkal. Az eluátumok: 60 65 térfogat koncentráhatóanyag Jelzés (1) ció (mg/l) (g) előfrakció 1. 8,2 32,5 0,27 előfrakció 2. 10,5 452,0 4,75 főfrakció 28,8 9600,— 276,5 utófrakció 9,0 410,— 3,7 6