167243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás redukált B12 vitamin (B12r), hidroxokobalamin, valamint alkilkobalaminok és sóik előállítására
167243 9 10 Fényforrásként PRK 2 típusú UV csövet (375 W) és 500 Wn izzót (500 wattos normál izzó + szűrő) alkalmazunk; az oldat átfolyási sebessége 0,5 l/perc, hőfoka 25 °C, fényforrások távolsága 30 cm, az oldat PH-ja 5. A fotolizáló reaktorból az izoláló csőbe folyatjuk az oldatot, ahol az N2 áram fenntartása mellett abszolút aceton 15-szörös mennyiségének hozzáadásával kicsapjuk a keletkezett fotolízisterméket, a B12r -t. Szűréssel elválasztjuk, a kapott termék súlya 4,2 g, redukált B13 vitamin (B 12r ). Kitermelés: 50,1%. 2. 50 g B12 koenzim kristályt tartalmazó vizes oldatot, melynek térfogata 50 1, koncentrációja 1000 mg/l — ez molekulasúly alapján számolva megfelel 850 mg/l hidroxokobalamin koncentrációnak, azaz 42,5 g-nak — 260 és 500 nm hullámhosszúságú fénykvantumokkal együttesen besugárzunk. A fényforrások távolsága az oldattól 35 cm, a fényforrások intenzitása 80 W Amikrob UV fénycső és 500 Wn izzó (4-szűrő). Az oldat pH-ja 5, hőmérséklet 20 °C, aktív rétegvastagság 12 mm. Fotolízis közben a rendszeren levegőt áramoltatunk át. A reakció lefutását spektrofotometriás módszerrel — azaz 351 nm-nél mért extinkció változással, mely a hidroxokobalamin jellemző abszorpciós maximuma — követjük. A számítást a következő módon végezzük: Az egyes eluátumok jellemzői: X% = Emax—E„ ahol X% = az átalakult B12 koenzim mennyisége, Et = a t időpontban mért extinkció 351 nmnél, E0 = a kiindulási B 12 koenzim oldat elnyelése 351 nm-nél, Em ax = a kiindulási B 12 koenzim teljes átalakulásához tartozó extinkció 351 nm-nél. A reakció 20 perc alatt 90%-ban végbemegy. Az átalakítás teljes ideje 60 perc. A fotokémiai átalakítás eredményeképpen a rendszer vízzel való átöblítése után 51 liter 810 mg/liter hidroxokobalamin koncentrációjú oldatot kapunk, amelynek hidroxokobalamin tartalma 41,3 g. A fotolizált oldatot H formájú CM-cellulóz-oszlopon átfolyatjuk. Az előkészített ioncserélő CM-cellulózzal 10 cm belső átmérőjű üvegcsövet töltünk meg, a töltet mennyisége egy oszlopban 1200 ml. Az átfolyatás sebessége v = 10 l/óra, lineáris sebesség 1,25 m/óra. Az oszlopon az adeninszármazékok és a változatlan B12 koenzim lassú vándorlása mellett a főtermék hidroxokobalamin erősen kötve marad. A CM-cellulóz desztillált vízből mért hasznos kapacitásának 50%át hasznosítjuk.A megkötés után alacsony molaritású pufFeroldattal, azaz 1.10-3 n nátriumacetát oldattal mosva eltávolítjuk az adenin-származékokat, majd a B12 koenzimet eluáljuk. Ezután az eluens elektrolit koncentrációjának növelésével 5.10-3 n értékű nátriumacetát koncentrációra, a főterméket eluáljuk, eközben az erősebben kötődött szennyező faktorok az oszlopon még kötve maradnak és 10~2 n nátriumacetát oldattal eluálhatök. Az egyes eluensek átfolyási sebessége W = 2 l/óra, mely v = 0,25 m/óra lineáris sebességnek felel meg. jelzés térfogat koncentráható(1) ció anyag (mg/l) (g) előfrakció 1. 5 10 0,05 előfrakció 2. 3 157 0,47 főfrakció 8 5125 41,1 utófrakció 2 40 0,08 10 A főfrakeiót aceton hozzáadásával kristályosítjuk. A kivált kristályokat 16 óra után szűrjük. 47,5 g 12% nedvesség tartalmú hidroxokobalamin-acetát kristályt kapunk, mely a gyógyszerkönyvi előírásnak megfelel: szárazanyagra számítva ez 40,1 g 15 hatóanyagtartalmat jelent. A kristályosítási anyalúg, mely 62 liter térfogatú, koncentrációja 160 160 mg/liter, 9,92 g hatóanyagot tartalmaz. A kromatografálási előfrakció 2.-t és az oldószeres kristályosítási anyalúgot egyesítjük. Nátriumcianid 20 adagolással a hatóanyagtartalmat B12 vitaminná (cianokobalamin) alakítjuk át. A B12 vitamin izolálására ismert módszerrel összesen 1,2 g B12 vitamint izolálunk az összesített anyalúgokból. így 42,5 g elméleti termékkel szemben 40,1 g hidroxoko-25 balainint és 1,2 g B12 vitamint kapunk, ami 97,4% kitermelésnek felel meg. 3. B12 koenzim kristályból 100 mg/l koncentrációjú oldatot készítünk 3X101 (a, b, c,) térfogatban. Az oldatot a 2. példában leírt módorL fotolizáljuk, 30 azzal a különbséggel, hogy három paralel fotolízist végzünk. a esetben 260 nm, b esetben 550 nm, c esetben együttesen 250 és 550 nm hullámhosszú-35 ságú fényt alkalmazva; a rétegvastagság mindhárom esetben 15 nm. Az egyes besugárzások 60 percig történtek. A fotolizált oldatból a terméket abszolút aceton hozzáadásával kristályosítjuk. A kristályosítás eredmé-40 nyeképpen az egyes termékek: a 0,85 g 12% nedvességtartalmú hidroxokobalamin-megfelel 0,75 vízmentesnek, b 0,82 g 12% nedvességtartalmú hidroxokobalamin — megfelel 0,72 vízmentesnek, 45 c 0,90 g 12%-os nedvességtartalmú hidroxokobalamin —• megfelel 0,79 vízmentesnek. Melléktermékként a kristályanyalúgokból kipreparálunk : a 0,07 g B12 vitamint, ami összesen 96,5% kiter-50 melést jelent, b 0,10 g B12 vitamint, ami összesen 96,4% kitermelést jelent, c 0,04 g B12 vitamint, ami összesen 97,6% kitermelést jelent. 55 4. A 2. példában leírt módon járunk el azzal a különbséggel, hogy eluensként ammóniumklorid oldatokat használunk, a leírt koncentrációk (normalitás) azonosak. Termékként 44,0 g hidroxokobalamin-kloridot kapunk, mely 38,0 g hatóanyagnak 60 felel meg, melléktermékként 2,5 g B12 vitamint kapunk. Kitermelés 95,5%. 5. A 2. példában leírtak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az elucióhoz elektrolit oldatként ammóniumszulfát különböző normalitású oldatait 65 használjuk. A kapott termék: 46,0 g hidroxokabala-5
