167243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás redukált B12 vitamin (B12r), hidroxokobalamin, valamint alkilkobalaminok és sóik előállítására
167243 3 4 gazdaságos hidroxokobalamin ipari méretű előállítása szempontjából. Ismeretes az is, hogy B12 koenzim nemcsak sav és ciánionok, de fény hatására is bomlik. Erre utal a koenzim első előállítójának, H. A. Barkernak a B12 koenzim előállítására vonatkozó 3,037.016. sz. USA-beli szabadalmi leírása, mely szerint az előállítást sav és cianid-iönok távollétében, fény kizárásával kell végezni. H. P. C. Hegenkamp: „Structure and chemical reactions of the cobamide coenzymes" (Annual of the New York Academy.:of Sciences, vol. 112. p. 552—564) című cikkében a B12 koenzim fotolizise le van írva látható fény (300 W égő hatására. Az átalakulás 60—70%-kai megy végbe és melléktermékként a cikk 8,5'-ciklikus adenozint, valamint egy sárgás-narancsszínű vegyületet ad meg, mely utóbbi nem oxidációs termék. Az „Influence of oxygen on the photolysis of coenzime B12" (Biochem. Biophys. Res. Communs. 4,373, 1961) című cikk szerzői a B12 koenzim fotolizisét kb. 40 gamma/ml koncentrációjú vizes oldatban, egy Cary 14 spektrofotométer kvarc küvettájában végezték 100 W-os lámpával. Felvették mind a kiindulási anyag, mind a termék spektrumát. Katalitikus hidrogénnel való redukció és az azt követő (Raney nikkellel, nemes fémekkel, vagy azok oxidjaival) oxidációval is lehet B12 vitaminból hidroxokobalamint előállítani. A hidrogénezést vizes vagy vizes-oldószeres közegben, normál nyomáson vagy 10—100 atü között végzik (Merck, 678.950. sz. angol szabadalmi leírás, 1949, Kaczka és mtsai, 2.738. 301. sz. USA-beli szabadalmi leírás, 1950 és Valu J., Székely Dénes, 153.741. sz. magyar szabadalmi leírás, 1966). A kitermelések viszonylag gyengék: 26,3 mg B12 vitaminból 12 mg hidroxokobalamin, a magyar szabadalmi leírás szerint körülbelül 80%. Az utóbbinál azonban az alkalmazott nyomás 10—100 atü között van. Hátránya az eljárásoknak, hogy a hidrogéngáz használata veszélyes, különösen magas nyomáson és drága az alkalmazott katalizátor. Maga a folyamat is nehezen szabályozható. B12 vitamin redukcióját erősen savas közegben cink-(vas)-por hozzáadásával vagy az oldatnak granulált cinkoszlopon való átfolyatásával, tehát nascens hidrogénnel is el lehet végezni (Böige J. és R. Cote: 916.186. sz. angol szabadalmi leírás, 1960, illetve 3.138.583. sz. USA-beli szabadalmi leírás, 1964). Az oxidáló gáz átbuborékoltatása után hidroxokobalamin keletkezik, mely ismert módon tisztítható a cink-(vas)-pornak az oldatból való eltávolítása után. A kitermelés körülbelül 80%, kristályosított, de előzőleg kromatografálással nem tisztított termékből. Az adott körülmények között a hidrogénezés nem tökéletes (a nascens hidrogén nyomásingadozása miatt) és ezért ez az eljárás nem bír ipari jelentőséggel. A 3,448.099. sz. USA-beli szabadalmi leírás az előző eljárások módosítása azáltal, hogy a cinkkel való érintkezés előtt a vizes savanyú oldathoz vízzel elegyedő szerves oldószert adagolnak, ami által jobb kitermelést és jobb minőségű terméket kapnak. Az angol 918.446. sz. 1961, illetve ennek továbbfejlesztése, az angol 1,070.042. sz. szabadalmi leírás, (1966), szerint savas közegben ferrosóval redukálják a B12 vitamint (cianokobalamint). Utána semlegesítenek nátriumhidroxiddal és oldatban oxidálnak levegő átbuborékoltatásával. A végső tisztítás 5 alumíniumoxid oszlopon való kromatografálással történik. Az első szabadalmi leírás szerinti eljárás kitermelése 50%, a módosított (továbbfejlesztett) szabadalmi leírás szerinti kitermelés kb. 80%. A redukciót titán vegyületekkel is el lehet vé-10 gezni (3,007.916. sz. USA-beli szabadalmi leírás) és bár a megadott kitermelés 90% körüli, az eljárás nagyon költséges a drága katalizátor használata miatt. A Glaxo Lab. Ltd. (974.284. sz. angol szabadalmi 15 leírás, 1961) a B12 vitaminból analógok segítségével állítja elő a hidroxokobalamint és közbenső termékként szulfito- és nitritokobalamin vegyületek képződnek. Az átalakítást erősen savas, pH 2—4 közötti közegben végzik. Tisztítás: dietilaminoetil-20 cellulózon, a nem kívánatos savanyú bomlástermékek eltávolítására. Bár a kitermelés igen jó (90% körül), hátrányos az erősen savas közeg és a nitrózus gázok használata. A kapott hidroxokobalamin tisztítására is több módszer van leírva részben az 25 előállítási, részben pedig csak a tisztításra vonatkozó szabadalmi leírásokban. Az előállítási eljárások leírásában a nyert hidroxokobalamin oldatokat a változatlan B12 vitamintól és esetleges szennyezésektől, melléktermékektől 30 (redukció folyamán képződött bomlástermékektől) extrakciós, ioncserés és adszorpciós úton tisztítják meg. A 158809. sz. magyar szabadalom szerinti eljárás igen jó kitermeléssel teszi lehetővé B12 koenzim elő-35 állítását és melléktermékként B12 vitamin kinyerését. Miután ennek alapján jobb hozammal és egyszerű módon nyerhető ki a B12 koenzim a fermentléből mint ha abból B12 vitamint izolálnának, felmerült az a gondolat, hogy szemben az eddig ismert 40 eljárásokkal, a hidroxokobalamint vagy más B12 származékokat B12 koenzimből, esetleg közbenső B12 koenzim koncentrátumból állítsuk elő. A találmány tárgya új eljárás redukált B12 vitamin (B12r ) és hidroxokobalamin előállítására B 12 45 koenzim fotokémiai átalakítása útján vagy 1—3 szénatomos alkil származékainak és/vagy sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy korrinoidokat termelő baktériumokká] való fermentálás során kapott B12 koenzim tartalmú biomassza feltárás után izo-50 Iáit nyers koncentrátumot vagy más B12 koenzim oldatot 260 nm és/vagy 550 nm hullámhosszúságú sugárkezelésnek vetjük alá és átalakulás után a reakcióelegyből közvetlenül a B12r vitamint vagy kívánt esetben megfelelő átalakítás, tisztítás és kris-55 tályosítás után annak fenti származékát izoláljuk. Az előállítás kiindulási anyagául tehát B12 koenzimet választunk és ennek fotokémiai úton történő átalakítását B12r -ré 550 ós/vagy 260 nm hullámhosszúságú fénykvantumokkal végezzük N2 áram-60 ban vagy ugyanezen körülmények között hidroxokobalaminná alakítjuk oxigén jelenlétében, optimális pH-n és hőmérsékleten. A fotolízis alatt a fotolizálandó oldat rétegvastagságának és koncentrációjának szorzatát megadott értékek között tart-65 juk, majd a kapott reakcióelegyet, mely N2 at-2
