167243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás redukált B12 vitamin (B12r), hidroxokobalamin, valamint alkilkobalaminok és sóik előállítására
167243 5 6 moszférában végezve a fotoanalízist B12r -t, megfelelő oxigén koncentrációt alkalmazva hidroxokobalamint, valamint esetlegesen át nem alakult B12 koenzimet és adenozinszármazékokat tartalmaz, lépcsős elúciós kromatográfiával választjuk szét. Ennek során az eluáló elektrolit normalitásának változtatásával az egyes komponenseket elkülönítjük egymástól és a főterméket tartalmazó eluátumból a hatóanyagot kristályosítással kinyerjük. A találmány azon a felismerésen alapszik, hogy oldatban levő B12 koenzim irányított és jól szabályozható módon, 260 vagy/és 550 nm hullámhosszúságú fénykvantumokkal kvantitatíve átalakítható B12r -ré, illetve hidroxokobalaminná. A sebességi állandó függését a fény hullámhosszától — 1/260 nm,2/550 nm, 3/260 nm és 550 nm egyidejű alkalmazása esetén meghatároztuk. A meghatározásoknál azonos koncentrációjú (1000 gamma/ml), azonos rétegvastagságú (12 mm) oldatokat használtunk és a megvilágítás azonos (35 cm) távolságból történt. A kísérletekhez használt fényforrás Amikrob típusú UV lámpa és normál Tungsram izzólámpa volt (550 nm hullámhossznak megfelelő szűrővel). A reakciókinetikai mérésekből kiszámítottuk az elsőrendű reakció sebességi állandóit. Ezek értéke a következő: kx = 0,029 perc -1 , k 2 = 0,056 perc -1 , k3 (k 1 +k 2 ) = 0,082 perc -1 . Az utóbbi állandó egyidejű megvilágítás esetén érvényes. A két hullámhosszat egyidejűleg alkalmazva a fénykvantumok hatása összegeződik. Az átalakítás során biztosítani kell az oldat speciális oxigénmentes, N2 gázzal való átöblítését B 12r termék esetén, vagy oxigénnel való telítettségét — mely egyszerűen levegőátbuborékoltatással is megoldható — hidroxokobalamin esetén, valamint 20—30 C° hőmérsékletet és pH 4—6 közötti értéket. A fotolízis során az oldat rétegvastagságát és koncentrációját a fényerősségtől függően kell megválasztani a következő összefüggés szerint: k = a = b —, c-d e ahol k = a fotokémiai reakció elsőrendű sebességi állandója, á, b = konstansok, I = a besugárzó fény intenzitása, c = a besugárzott oldat koncentrációja, d = a besugárzott oldat rétegvastagsága, e = a besugárzott oldat extinkciója. Megállapítottuk továbbá, hogy a leírt módon kapott reakcióelegy tartalmaz B12r-t vagy hidroxokolamint és adenin származékokat, tartalmazhat ezen kívül át nem alakult B12 koenzimet és a kiindulási oldat eredeti szennyezéseit. B12r előállítása esetén a terméket abszolút aceton hozzáadásával a reakcióelegyből kicsapjuk és a terméket szűréssel elválasztjuk. Hidroxokobalamin előállítása esetén a fotolízist oxigénáramban végezzük, de oxidálhatunk a fotolízis befejezte után, amikor N2 gáz helyett a rendszeren levegőt fúvatunk át. Egyéb származékok, mint alkilkobalaminok esetén a N2 áramban végzett fotolízis után azonnal alkilezzük a redukciós terméket, melynek során alkilkobalamint kapunk. E terméknél a fotolízist is célszerű oldószeres közegben végezni és a reakció befejezte után abszolút aceton hozzáadásával a terméket kristályosítani. A reak-5 cióelegyet a fotolízis befejeztével -fénytől védjük. Hidroxokobalamin termék esetén alkalmazhatunk közvetlen kristályosítást, illetve eljárhatunk úgyis, hogy a reakciókomponenseket H-formábán levő karboximetilcellulózról megfelelő elúciós lép-10 csők alkalmazásával frakcionáltan különítjük el, miután azokat előzőleg desztillált vizes oldatban azon megkötöttük. Az egyes komponensek leoldását és elválasztását az eluáló oldat, az elektrolit (só) koncentrációjának 15 változtatása teszi lehetővé. A hidroxokobalamint tartalmazó főfrakcióból a termék kikristályosítható. A feldolgozás és tisztítás során kapott kobalamin tartalmú melléktermékeket összegyűjtve, azokat egységesen B12 vitaminná alakítva, ismert módon 20 kristályosan nyerjük ki. A B12 koenzim kristályból vagy a B 12 koenzim tartalmú koncentrátumból, cVZclZ cl B12 koenzim feldolgozási folyamat (158.809. sz. magyar szabadalmi leírás) valamely fázisában kapott vég- vagy köz-25 benső termékből, 100—5000 mg/l koncentrációjú (pH 4—6 közötti) desztillált vizes (vagy oldószeres) oldatot készítünk, melyet 0,1 mm—15 mm rétegvastagság mellett 260 és/vagy 550 nm hullámhoszszúságú fénnyel megvilágítunk. Célszerű a két kü-30 lönböző hullámhosszúságú fényt egyidejűleg alkalmazni. Fotolízis közben az oldaton N2 -t áramoltatunk át, illetve levegőt vagy oxigént vezetünk keresztül, mely szükséges a fotokémiai redukció termékének, a B12r -nek megvédésére, illetve hidroxo-35 kobalaminná való átalakításához. A reakció sebességét az eddig felsoroltakon kívül a fényforrás intenzitása, illetve annak az oldattól való távolsága befolyásolja (határozza meg). Előnyös, ha a fotolízist folyamatos üzemben, megfelelő 40 berendezésben végezzük, ami azt jelenti, hogy adott megvilágítási intenzitás, oldatkoncentráció és rétegvastagság mellett a reakció lefolyását az oldat átfolyási sebessége szabályozza. A folyamatot reakciókinetikai mérések segítségé-45 vei ellenőrizzük. A reakció csekély mértékű függése a hőmérséklettől indokolatlanná teszi annak szobahőfoknál magasabb hőmérsékleten való kivitelezését. A reakcióelegyet tartalmazó oldatot a terméktől függően többféleképpen dolgozhatjuk fel. B12r ese-50 tén, az N2 áram megtartása mellett abszolút acetont adagolva kicsapjuk a terméket, majd szűréssel elválasztjuk. Alkilkobalaminok előállítása esetén a fotolízist alkilezés követi, melyet végezhetünk a kicsapott 55 B12r termék alkoholban való oldása után metilkobalamin előállítása esetén metilalkoholt, etilkobalamin esetén etilalkoholt használva oldószerül, majd metiljodid, illetve etiljodid hozzáadásával alkilezünk az N2 áramot fenntartva, fénytől védve. 60 Eljárhatunk olyan módon is, hogy a kívánt oldószerben oldjuk a B12 koenzimet és a fotolízist is ilyen közegben végezve, annak befejezte után azonnal adagoljuk az alkilezőszert. Hidroxokobalamin előállítása esetén a fotolízis 65 után, vagy már a fotolízis közben levegő vagy oxi-3
