167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
167238 85 86 35 mg, a 2. példa 44. pontja szerinti védett doko-zapeptidamidot, 24 mg a Lau-Cys-Gly-Asn-Ser(tBu) -Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH, 6 mg N-hidroxiszukcinimid és 0,8 ml dimetilformamid elegyét 1 .órán át 50°-on, nitrogénatmoszférában keverjük, 6 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá, további két órán át keverjük nitrogénatmoszférában és 50°-on, mégegyszer 3 mg N-hidroxi-szukcinimidet és 3 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá és 8 órán át nitrogéngáz alatt 50°-on keverjük. Ezután az egész elegyet 60 ml peroxidmentes éterbe öntjük, 18 órán át 0°-on állni hagyjuk, a finom csapadékot leszűrjük és vákuumban 40°-on szárítjuk. 30 g nyers védett CysMauril-dotriakontapeptidamidot kapunk. Tisztítás céljából a nyers terméket metanol-kloroform (1:1) elegyben oldjuk és leszálló rendszerben hasonló rendszerrel készített Sephadex LH 20 oszlopon (1,5X 30 cm) kromatográfiaijuk. 3 ml-es frakciókat szedünk, ezeket egyenként bepároljuk és tisztaságukat szilikagéles lemezeken végzett vékonyrétegkromatográfiás módszerrel vizsgáljuk. (Rf52A = 0,55.) 15 mg tiszta, védett dotriakontapeptidamidot kapunk. 11. példa H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2-acetát (kalcitonin M acetát) 32 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)--Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg vegyületet a 2. példában leírt módon megszabadítunk a védőcsoportoktól. A keletkezett kalcitonin M acetát a vékonyrétegkromatográfiás és az elektroforetikus vizsgálatok szerint megegyezik a 2. példában leírt termékkel. „Alox"-alumíniumoxidon végzett vókonyrétegkromatográfiás eljárás során Rf52 = 0,48, R^ 5 = 0,41, Rf79 = = 0,55. Cellulózon (Selecta kész lemezek, S+S Nr. 1440) vékonyrétegkromatográfiában Rf101 A = 0,54, Rf45 = 0,40. Cellulózon (Selecta kész lemezek Nr. 1440) végzett elektroforézisnél az elmozdulás a katód felé 4,0 cm (280 V, 1,5 óra, pH 9,10), pH 4,85-nél 4,2 cm. A kiindulási anyagként alkalmazott védett dotriakontapeptidamidot a következőképpen állíthatjuk elő: 1. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)--Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 126,5 mg BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH (1. példa 17. pont) és 189,0 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (1. példa 56. pont) vegyületeket 5 és 31,4 mg N-hidroxiszukcinimidet 2,5 ml N,N-dimetilformamidban nitrogéngáz alatt szuszpendálunk. 37 mg diciklohexilkarbodiimid 1 ml dimetilformamidos oldatát adjuk hozzá és 4 órán át 45°-on keverjük. Az elegyet 250 ml kevert abszolút éterbe 10 öntjük, a pelyhes csapadékot leszűrjük és éterrel mossuk. 314 g metanolban nehezen oldódó anyagot kapunk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf100 = 0,7, Rf52 A = 0,56, RJJJE = 15 = 0,65. 2. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-20 -Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr -(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Giy-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 219 mg, 1. pontban leírt védett dotrikontapeptidamidot meleg dimetilformamidban oldunk és szoba-24 hőmérsékleten 30 perc alatt 124 mg frissen szublimált jód 30 ml metanolos oldatához csepegtetjük. 2,5—2,5 ml dimetilformamiddal kétszer bemossuk, majd egy órán át szobahőmérsékleten keverjük és azután 0°-on 1,25 ml 1 n nátriumtioszulfátoldat las-30 sú hozzáesepegtetésével az oldatot megközelítően színtelenítjük. Ezután 0,05 ml 2 n vizes nátriumhidroxidoldatot csepegtetünk hozzá és vákuumban kb. 1/3-ára pároljuk be. Az oldatot 450 ml peroxidmentes éterben elkeverjük és a csapadékot leszűr-35 jük. A szűredéket közvetlenül Craig-megoszlatásnak vetjük alá, metanol-puffer-kloroform-széntetraklorid (11:3:6:7) rendszerben (puffer ugyanaz, mint az 1. példa 18. pontjában alkalmazott). 280 lépcső után az anyag a 100—132. frakcióban található. Ezt izo-40 láljuk és ugyanebben a rendszerben ismét, ezúttal 560 lépcsőig megoszlatjuk. A vékonyrétegkromatográfiával elkülönített terméket izoláljuk (K = 0,69) és nagy vákuumban 40°-on megszabadítjuk az ammóniumacetáttól. 45 Szilikagélen végzett vókonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf52 A = 0,4, Rf100 = 0,35, Rfg7 = == 0,66, Rf43H = 0,59. 12. példa 50 A 2. példában kiindulási anyagként alkalmazott védett kalcitonin M-et az 1—28. és 29—32. fragmentekből a következőképpen állítjuk elő: 1. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys --Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH 60 800 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu) -Cys-Met-Leu-Gly-OH (2. példa 12. pont) 7 ml di-metilformamidos oldatához 0°-on 0,1 ml trietilamint és 292 mg triklórecetsav-pentaklórfenilésztert adunk 65 és 1 órán át 0°-on nitrogéngáz alatt keverjük. Ez-43
