167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
167238 87 88 után 1,627 g H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH (1,75 g, 1. példa 49. pontban leírt vegyületből 80%-os ecetsavoldatban hidrogénezéssel előállítva) vegyületet, 0,09 ml trietilamint és 7 ml dimetilformamidot adunk hozzá és egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. A jéghideg 0,02 n sósavba öntés után kivált nyers terméket ellenáramú megoszlatással, metanol-puffer-kloroform-széntetraklorid (11:3:6:7) puffer ugyanaz, mint az 1. példa 18. pontjában) rendszerrel tisztítjuk. Megoszlási hányados K = 0,8. Az oktakozapeptidszármazékot tartalmazó frakciókat összeöntjük, az oldatot erősen bepároljuk és terc-butanolból liofilizaljuk. A termék szilikagéles vékonyrótegkromatogram: Rf45 = 0,33; Rf 10 o = = 0,35, Rfll5 = 0,48. 2. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 _50 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)--Cys-Met-Leu-Gly-Thr-tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly OH és 27 mg H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 (2. példa 42. pont) vegyületeket 1 ml dimetilformamidban oldunk. Az oldathoz 2,9 mg N-hidroxiszukcinimidet és 8,3 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk és az így kapott oldatot 2 órán át nitrogéngáz alatt keverjük. További 1,7 mg N-hidroxiszukcinimidet és 5,5 mg diciklohexilkarbodiimidet (mindkettőt 0,1—0,1 ml dimetilformamidban oldva) csepegtetünk hozzá, és további 3 órán át 45° hőmérsékleten keverjük. Ezután az átlátszó oldatot 50 ml éterbe öntjük, a csapadékot leszívatjuk, szárítjuk, kevés vízzel eldörzsöljük, leszívatjuk és a még nedves port metanolvíz elegyből kicsapjuk. Ezáltal a nyers terméken található tetrapeptidszármazék felesleget elválasztjuk. A keletkezett védett kalcitonin M a 2. példa 45. pontjában megadott Rf-értékeket mutatja. A védőcsoportok lehasítása a 2. példában leírt módon történik. A keletkezett, szabad kalcitonin M a szulfoxidszármazék nyomait tartalmazza, egyébként azonban tiszta. A termék biológiai aktivitása 80 E/mg. 13. példa Zn-komplex képzésére a következő szuszpenziót állítjuk elő: Kalcitonin M 1,0 mg ZnCl2 5,25 mg Na2 HP0 4 -2H 2 0 1,05 mg NaCl 2,0 mg 0,5 n NaOH-oldat (pH 8,6 értékig) desztillált víz 1 ml-re. 14. példa H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr--Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2-acetát kalcitonin M-acetát) 200 mg H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-5 -Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet 5 ml jégecetben oldunk és intenzív keverés közben 3 g jód 200 ml jégecettel készített oldatába csepegtetjük. Az elegyet egy órán 10 át szobahőmérsékleten keverjük, majd 300 ml petrolétert adunk hozzá, majd annyi vizet, hogy a petroléteres fázis elváljon. Ezután a jódfelesleget a petroléteres fázisba extraháljuk, a petroléteres fázist elválasztjuk, és az ecetsavas fázist addig mossuk 15 petroléterrel, míg több jód nem extrahálható ki, és a petroléter színtelen marad. Ezután az ecetsavas oldatból forgó bepárlóban vákuumban eltávolítjuk a maradék petrolétert, majd az oldatot liofilizaljuk. A maradékot 320 lép-20 esős ellenáramú megoszlatásnak vetjük alá, n-butanol-ecetsav-víz (4:1:5) rendszerben. A tiszta kalcitonin M a 101—117. frakciókban található (maximum a 109. csőben, K = 0,52). A fenti csövek tartalmát egyesítjük, és forgó bepárlón 45° fürdőhő-25 mérséklet mellett szárazra pároljuk. Ily módon 177 mg kalcitonin M-acetátot kapunk, melynek fizikai állandói megegyeznek az 1. példában leírtakkal. A kiindulási anyagot a következőképpen állítjuk 30 elő: 1. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr (tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-35 -Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHa 126,6 mg BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH és 189,0 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(tBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-40 -Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH 2 vegyületet és 31,4 mg N-hidroxiszukcinimidet 2,5 ml N,N-dimetilformamidban szuszpendálunk. Az elegyhez 37 mg diciklohexilkarboxiimid 1 ml dimetilformamidos oldatát adjuk, majd 4,5 órán át 45°-on keverjük. 45 A reakcióelegyet ezután 250 ml kevert éterbe öntjük, a pelyhes csapadékot leszűrjük és éterrel mossuk. Ily módon 314 mg, metanolban rosszul oldódó védett ditril-dotriakontapeptidamidot kapunk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizs-50 gálát során Rf100 = 0,51, Rf 10 7 = 0,773^1« = 0,65 és Rf5 2A = 0.56. 2. H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-55 Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 280 mg BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr (tBu)-Thr(tBu)-Bln-Asp-(OtBu)-Phe-Asn-Lys 60 (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr-(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet 4,5 ml jéghideg 95%-os trifluorecetsavban oldunk, az oldatot 25°-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten 45 percig állni hagyjuk. Ezután a reakcióelegyet 65 ismét 0°-ra hűtjük, és 50 g jég és 2 n káüumkarbo-44
