167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
167238 83 84 hozzácsepegtetve elszíntelenítjük. A tiszta oldatot először vízsugárszivattyúval előállított, majd nagy vákuumban 30°-on kb. 10 ml-re pároljuk be, 2Q0 ml éter-petroléter (1:1) elegyet adunk hozzá és dekantáljuk. A maradékot rövid, vízsugárszivattyúval előállított vákuumban végzett szárítás után háromszor 10—10 ml vízzel eldörzsöljük és nátriumhidroxid felett szárítjuk. Tisztítás céljából kloroformpetroléter elegyből kicsapjuk. Szilikagélen végzett vekonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf^ = = 0,50. . . • ,' '•!•••••• I ' 6. Pal-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys--Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp-(OtBu)-Phe--Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHa 418 mg Pal-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH, 290 mg, a 2. példa 34. pontjában leírt védett dokozapeptidamid és 110 mg N-hidroxiszukcinimid 15 ml frissen desztillált dimetilformamidos oldatához keverés és 45°-on melegítés közben 135 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk. Még három óráig nitrogéngáz alatt keverjük 45°-on, mégegyszer 70 mg N-szukcinimidet és ugyancsak 70 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá és még 4,5 órán át keverjük 45°-on. Ezután 0°-ra hűtjük le és 300 ml jéghideg, peroxidmentes éterre öntjük. 12 óráig 0°-on tartjuk, majd a csapadékot leszívatjukj éterrel mossuk és vákuumban 40°-on szárítjuk. Tisztítás céljából a terméket metanol-kloroform (1:1) elegyben oldjuk és ebben az oldó szerelegyben Sephadex LH20 110x4,2 cm-es oszlopon kromatografáljuk. 3 ml-es frakciókat szedünk és vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. Szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során az Rf52A = 0,62. 10. példa i i Lau-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr*Cys-Met-Leu-Gly--Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Eal-Gly-Ala-Pro-NH2-hidroklorid (CysMauril-kalcitonin M hidroklorid) 7 mg Lau-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pr-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyülethez keverés közben 0,42 ml jéghideg, analitikailag tiszta tömény sósavat adunk és nitrogénatmoszféra alatt 10 percig 0°-on keverjük. Ezután gázalakban oldott sósavgázt 1 percig 0°-on 0,01 torr nyomásra evakuálva eltávolítjuk, majd 6 ml terc-butanolt adunk hozzá és az elegyet liofilizáljuk. így 5 mg CysMauril-kalcitonin M monohidrokloridot kapunk. , A Kumar és munkatársai (J. Endocrinology 33, 469'(1965)) által megadott vizsgálat során a termékét a kalöitonin M-nél hosszabb hatásúnak találtuk» A kiindulási anyagot a következőképpen állíthatjuk «lő: 1. Laurinsav-p-nitrofemlészter (Lau-ONP, dodekánsav-p-nitrofenilészter) A vegyületet ugyanúgy állítjuk elő, mint a palmi-5 tinsav-p-nitrofenilésztert a 10. példában, 5,0 g p-nitrofenolból és 7., 2 g laurikloridból kiindulva; 2. Lau-Cys(TRI),Gly-Asn-Leu-OMe 10 1,5 g laurinsav-p-nitrofenilészter és 1,65 g H-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe-acetát (4. példa 2. pont) elegyét 25 ml dimetilformamidos közegben 24 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldószert lepároljuk és metanolos kicsapással vé-13 konyrétegkromatográfiásan egységes termék keletkezik. Rf53 = 0,60, szilikagélen. 3. Lau-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH2 1,0 g Lau-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe vegyüle-20 tet 40 ml metanolban és 4 ml hidrazinhidrát hozzáadásával 40 ml metanolban és 4 ml hidrazinhidrát hozzáadásával 24 órán át szobahőmérsékleten hidraziddá reagáltatunk. Az izolálás az oldat bepárlásával és 0,5 n ecetsavoldattal kicsapva történik. 25 Rf100 = 0,40 (szilikagélen). 4. Lau-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH 30 1,42 g Lau-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NHa 10 m1 dimetilformamidos oldatához; —15°-on 1,38 ml 2 n etilacetátos sósavoldatot és 0,14 ml terc-butilnitritet adunk, 15 perces, —10°-on történő állás után 965 mg H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-35 -Gly-OH (2. példa 10. pont) és 0,525 ml trietilamin 10 ml dimetilformamidos, —10°-ra lehűtött oldatát adjuk és egy órán át —10°-on és 15 órán át 0°-on állni hagyjuk. A reakcióelegyből gélként keletkezett terméket 20 ml metanol hozzáadásával teljesen ki-40 csapjuk, szűrjük és háromszor 10^—10 ml vízzel eldörzsöljük, majd nátriumhidroxid felett szárítjuk. Tisztítás céljából forró metanolból kicsapjuk. 45 5. Lau-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH 1,0 g jód 150 ml metanolos kevert oldatához szobahőmérsékleten 20 perc alatt 700 mg Lau-Cys (TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-50 -Met-Leu-Gly-OH 50 ml dimetilformamidos oldatát csepegtetjük és még egy órán át tovább keverjük. Az oxidálószerfelesleg eltávolítására 0°-on 1 n tioszulfátoldatot csepegtetünk hozzá és vízsugárszivattyúval előállított, majd nagy vákuumban kb. 55 10 ml-re pároljuk be. 200 ml éter-petroléter (1:1) elegyet hozzáadva kicsapjuk, a szárított csapadékot háromszor vízzel eldörzsöljük, nátriumhidroxid felett szárítjuk és tisztítás céljából kloroform-petrolóter elegyből kicsapjuk. 6. Lau-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-ne-Gly-Val-65 -Gly-Ala-Pro-NH2 42.N
